Vom His-tag zur ChIP-Analyse

Transkript

1 Die verschiedenen Methoden der Affinitätsreinigung von Proteinen Vom His-tag zur ChIP-Analyse Felix Steinbacher Hochschule München BOD8

2 Hochreine Proteine In vielen Bereichen der Industrie, Medizin und Forschung werden hochreine Produkte benötigt z.b. als } Arzneimittel, } Nahrungsergänzungsmittel } oder in Waschmittel und } analytische Verfahren

3 Aufreinigungsmethoden } Aufreinigung der Proteine erfolgt auf Grund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften } Gelpermeationchromatographie: Größe } Adsorptionschromatographie: hydrophile/hydrophobe Wechselwirkung } Ionenaustauschchromatographie: Ladung } Chromatofokussierung: isoelektrischer Punkt } Affinitätschromatographie: Bindung an einen speziellen Liganden

4 Affinitätschromatographie } Spezifische, reversible Adsorption eines Moleküls an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner (Antikörper / Antigen, Glycoproteine / Lektine, Enzyme und Coenzyme) } Elution erfolgt durch kompetitive Verdrängung oder Änderung der Ionenstärke oder des ph-wertes (Konformationsänderung)

5 Affinitätschromatographie } Typische Bindungspartner Gruppenspezifische Liganden Lectine Glycoproteine Protein A IgG Protein G IgG Farbstoffe Enzyme monospezifische Liganden Antikörper Antigen Inhibitoren Enzyme Hormon Rezeptor

6 Ligandengekoppelte Affinitätsmatrix } Neben einsatzbereiten, kommerziell erhältlichen Affinitätsmatrizen gibt es aktivierte Gele

7 Antikörper in der Affinitätschromatografie } Antikörper als spezifische Bindungspartner

8 Fusionierte Proteine Gen des Proteins wird mit Gen für einen spezifischen Liganden(Tag) kombiniert Tags Ligand Protein A IgG Streptavidin Biotin Glutathion-S-Transferase (GST) Glutathion Maltose-Bindungsprotein (MBP) Stärke Intein/Chitin-Bindungsdomäne Chitin poly-arg Ionenaustauschchromatographie poly-glu Ionenaustauschchromatographie poly-his Komplexierung mit Ni2+ Ta g P R O T E I N

9 Tag-Entfernung In den meisten Fällen möchte man das Tag nach der Reinigung wieder entfernen. Eine Möglichkeit ist das Einfügen von Erkennungssequenzen für spezifische Proteasen zwischen Tag und Protein. Manche Tags werden zur effizienteren Bindung an die Matrix in mehreren Kopien benutzt

10 Selbstspleißende Proteine

11 His-Tag Gen des gewünschten Proteins 2. Auftragen auf Säule 3.Elution Affinitätstag 1. Expression Zellaufschluss Zentrifugation Protein mit Tag Elution erfolgt mit einem Imidazolgradienten (fkt. Grp. des Histidins)

12 Bio-Chips } Definition: Möglichst großer Satz an verschiedenen Proteinen wir rasterartig auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert (stark miniaturisierte und hochparallele Analyse von Proteininteraktionen) } Einteilung: } Antikörper-Arrays: Hochaffine Capture Proteine (i.r. Antikörper) werden benutzt um in komplexen Stoffgemischen Vorkommen, Konzentration und Bindungsaffinitäten von Analyten zu messen } Protein-Arrays: Verschiedene Proteine oder Proteindomänen auf der Oberfläche interagieren mit bekannten Analyten (neue Protein-Protein-WW, Medikamenten-WW, Substratumsetzungen, DNA-Bindungsdomänen) } Reversed-Phase-Arrays: Zelllysate verschiedener Zellen werden auf die Chipoberfläche aufgebracht und mit einem bestimmten Antikörper beprobt, der ein relevantes Protein erkennt.

13 Immobilisierung Ziel: möglichst viele Proteine in aktiver Form fest immobilisieren, geringes Signal/Rauschen- Verhältnis, Nutzung herkömmlicher Arrayer und Reader Diffusion in Polyacrylamid- und Agarosegele (Hydrogel) Adsorption an Oberfläche (Polyvinylidonfluorid-PVDF, Poly-L-Lysin, Nitrozellulose) Kovalente Bindung an funktionalisierte Glasoberfläche (Silane, Aldehyde, etc.) Affinitätst-Tags: Fusionsproteine (z.b. GST, His-Tag)

14 Herstellung Gerichtete Immobilisierung auf Glasoberflächen } Funktionalisierung } Aktivierung } Immobilisierung

15 Detektion Markierungen: } Fluoreszenzmarkierung } Radioaktive Markierung } Enzymmarkierung

16 Anwendung von Proteinarrays } Anwendungen dieser Technologie liegen im Bereich Diagnostik und beim Studium von Protein-Protein- Wechselwirkungen

17 Anwendung von Proteinarrays

18 Anwendung } Reverse Phase Array (Low Density Lysate and Serum Array) } Clontech Laboratories - Antibody Array