Quantitative Analytik Elektrophorese. Bei dieser Gruppe von Methoden werden Ionen durch Anlegen eines elektrischen Feldes transportiert.

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1 Quantitative Analytik Elektrophorese 9. ELEKTROPHORESE Bei dieser Gruppe von Methoden werden Ionen durch Anlegen eines elektrischen Feldes transportiert. Elektrophoretische Mobilität von Ionen in Lösung: Ein Ion im elektrischen Feld erfährt die Kraft F: F = z e 0 E wobei z = Ionenladung e 0 = Elementarladung E = elektrische Feldstärke Andererseits erfährt das Ion eine Reibungshinderung (Stokessches Gesetz, Bewegung von Kugeln durch ein viskoses Medium): F = 6 π η ν r wobei F = Kraft η = Viskosität ν = Geschwindkeit r = Radius Es gilt nun: z e 0 E = 6 π η ν r

2 Quantitative Analytik Elektrophorese Die spezifische Grösse für jede Ionensorte, die Mobilität, µ, ist gegeben durch den folgenden Quotienten: µ = ν / E Es ist zu beachten, dass der Radius des hydratisierten Ions massgebend ist, und dass H + und OH - Ausnahmen darstellen. Unterschiedliche Varianten der Elektrophorese kommen zum Einsatz: Zonenelektrophorese: Die unterschiedliche Mobilität (µ) im elektrischen Feld (Verhältnis Ladung zu Grösse) führt direkt zur Trennung. Für grosse organische Ionen (Proteine etc.) Siebung nach Grösse (Molekulargewicht) in einem Gel ("Gelelektrophorese")(die elektrophoretische Mobilität sorgt nur für den Transport) Isoelektrische Fokussierung von Biomolekülen in einem ph-gradienten und andere In der Regel können bei den elektrophoretischen Methoden bessere Trenneffizienzen als bei der Chromatographie erzielt werden.

3 Quantitative Analytik Elektrophorese 9.1 Planare Elektrophorese Hautpsächlich zur Trennung von Biomolekülen (Proteine, DNA). Die Proben werden, ähnlich wie bei der Dünnschichtchromatographie, auf eine Folie aufgegeben, welche mit einem gequollenen Gel aus Agarose oder Polyacrylamid beschichtet ist. Beide Enden werden in mit Puffer gefüllte Gefässe gehängt und eine Spannung von einigen Hundert Volt angelegt. Visualisierung: Mittels Farbstoffen (weit verbreitet: das fluoreszierende Coomassie brilliant blue) oder mittels Silber (silver staining), durch Reduktion von Silbernitrat. Anwendungsbeispiel:

4 Quantitative Analytik Elektrophorese 9.2 Kapillarelektrophorese (Capillary Electrophoresis / CE) Um ausreichende Feldstärken zu erreichen müssen recht hohe Spannungen an Trennsäulen angelegt werden (bis 30 kv an Kapillaren von etwa 75 cm Länge). Um die geflossenen Ströme, und damit die entstehende Leistung (P = E I), welche als Joulesche Wärme abgeführt werden muss, niedrig zu halten, müssen die Durchmesser klein gehalten werden (Kapillaren: < 100 µm). Je kleiner der Durchmesser umso effizienter ist auch die Kühlung. Die Instrumentierung ist prinzipiell im Vergleich zur Chromatographie recht einfach und daher billiger, da keine Pumpe sondern lediglich ein Hochspannungsnetzteil benötigt wird. Zur Trennung werden vergleichsweise billige Quarzglaskapillaren (fused silica) verwendet. Die Injektion wird entweder hydrodynamisch (durch Anlegen von Druck oder Vakuum) oder elektrokinetisch (Anlegen von Spannung) durchgeführt. Auf der Kapillaroberfläche besteht in Abhängigkeit des ph-wertes und der Ionenstärke eine elektrische Doppelschicht bedingt durch die Dissoziation von Silanolgruppen. Die mobilen Gegenionen wandern im elektrischen Feld und verursachen einen elektroosmotischer Fluss. Dieser elektroosmotische Fluss überlagert sich mit der elektrophoretischen Wanderung der Ionen und beschleunigt Kationen zum Detektor hin bzw. transportiert Anionen gegen deren elektrophoretische Wanderung.

5 Quantitative Analytik Elektrophorese Langsame Anionen werden manchmal gegen deren elektrophoretische Wanderung getrennt. In der Regel wird aber der elektrophoretische Fluss durch Zugabe eines quaternären Amines für die Anionenbestimmung umgedreht.

6 Quantitative Analytik Elektrophorese Die Detektion erfolgt direkt auf der Kapillare optisch (UV-Absorption oder Fluoreszenz) oder am Kapillarende (elektroanalytisch oder Massenspektroskopie). Nachteile im Vergleich zur Ionenchromatograpie sind die kleinen zur Verfügung stehenden Detektionsvolumen (Nachweisgrenzen) und die Tatsache, dass die Retentionszeiten nicht ganz stabil sind.

7 Quantitative Analytik Elektrophorese Anwendungsbeispiele: Anorganische Kationen mit kontaktloser Leitfähigkeitsdetektion:

8 Quantitative Analytik Elektrophorese Das Antibiotikum Tobramycin in Serum mittels kontaktloser Leitfähigkeitsdetektion: Trennung der optischen Enantiomeren einer pharmazeutischen Substanz durch Zugabe eines Cyclodextrins als chiralen Selektor: