Abbildungsverzeichnis

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1 I INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungen VI Abbildungsverzeichnis VIII I. Einleitung 1. Neurone und Axonwachstum 1 2. Oligodendrozyten und Myelin 3 3. Das Proteolipid Protein (PLP) 6 4. Mutationen im PLP-Gen und PLP-defiziente Mäuse 7 5. Die Proteolipid-Genfamilie 9 6. M6A / EMA (Edge Membrane Antigen) Das Zelloberflächenprotein M6B Zielsetzung der Dissertation 16 II. Ergebnisse 1. Lokalisation von M6B M6B-Expression in primären Zellen M6B-Expression in Neuronen M6B-Expression während der Oligodendrozyten-Differenzierung Expressionsanalyse von M6B-Isoformen Expressionsanalyse der M6B-RNA Northern Blot-Analyse Regulierte M6B-mRNA-Expression während der Gehirnentwicklung der Maus Expression der M6B-mRNA während der Oligodendrozyten-Differenzierung Herstellung von isoformspezifischen M6B-Antiseren Western Blot Analyse der Seren Immunzytochemische Analyse der Seren Molekulare Klonierung eukaryontischer M6B-Expressionskonstrukte Expression von M6B-Isoformen in heterologen Zellen 34

2 II 3. Ausläuferbildung nach M6B-Überexpression Endogene Expression von M6B in PC12-Zellen in An- oder Abwesenheit von NGF Überexpression von M6B in PC12-Zellen Die Ausbildung der Ausläufer ist spezifisch für M6B Zelltyp unabhängige Ausläuferbildung Entstehen die Filopodien aufgrund der Aktivierung einer Signaltransduktionskaskade? Analyse von M6A- und M6B-defizienten Mäusen Analyse M6A-, M6B- und M6A*M6B-defizienter Neuronen in vitro Phänotypische Analyse M6A- und M6A*M6B-defizienter Mäuse Interaktion von M6B mit dem Proteolipid Protein Transport von jimpy-plp wird durch N-terminale Modifikationen beeinflusst Einführung von Mutationen im M6B-Protein 53 III. Diskussion 1. Funktion von Proteolipiden: eine Übersicht Ausläuferbildung nach M6B-Überexpression Endogene M6B-Expression in PC12-Zellen Zelluläre Überexpression induziert die Bildung von Ausläufern NGF hat keinen Einfluss auf die M6B-induzierte Ausläuferbildung M6B-bedingte Ausläuferbildung ist unabhängig von der überexprimierten M6B-Isoform Ausläuferbildung durch M6B ist auch in primären Hippocampus-Neuronen zu beobachten Die Ausläuferbildung ist spezifisch für M6B Handelt es sich bei diesen induzierten Ausläufern um Filopodien? Mögliche Mechanismen der Ausläuferentstehung Analyse M6A*M6B-defizienter Mäuse Motorische Fähigkeiten doppeldefizienter Tiere nehmen im Alter ab jp-plp als Mittel um die Interaktion zwischen Proteolipiden zu zeigen Der Transport von jp-plp wird durch N-terminale Modifikationen beeinflusst 71

3 III IV. Material 1. Chemikalien Allgemeine Chemikalien Zellkultur-Chemikalien Verbrauchsmaterial Allgemeines Verbrauchsmaterial Zellkultur-Verbrauchsmaterial Geräte Lösungen und Puffer Lösungen für die Gelelektrophorese Lösungen für RNA-Präparationen und Nothern Blot Hybridisierung Sonstige Puffer und Lösungen Medien Medien zur Bakterienkultivierung Zellkulturmedien Immunzytochemie Proteinbiochemie Histochemie Reaktionskomplettausstattungen Enzyme Antikörper Tiere, Zellinien, Bakterien und Vektoren Tiere Zellinien Bakterienstämme Vektoren und Konstrukte Größenmarker für DNA und Proteine für die Gelelektrophorese Radioaktiv markierte Oligonukleotide Oligonukleotide Hard- und Software 89 V. Methoden 1. Molekularbiologische Methoden Präparation und Analyse von Nukleinsäuren Reinigung und Konzentrierung von DNA Plasmidpräparation aus Bakterien Präparation genomischer DNA aus Mausschwanzgewebe 90

4 IV Phenol/Chloroform-Präparation von RNA aus Geweben Präparation von RNA aus Geweben Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Agarose-Gel-Elektrophorese von DNA Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese von DNA Denaturierende Formaldehyd-Gelelektrophorese von RNA Elution von DNA aus Agarose-Gelen a Elution von DNA mit NA45 Anionenaustauscherpapier b Phenol/Chloroform-Extraktion Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden und Größenmarkern (Kinasieren) Northern Blot Hybridisierung Methoden zur molekularen Klonierung Restriktionsverdau von DNA Dephosphorylierung von Vektoren Generierung von blunt-enden Ligation von DNA-Fragmenten Klonierung von PCR-Produkten Transformation von Bakterien Blau-Weiß-Selektion auf X-Gal/IPTG-Platten Herstellung von cdna Polymerase-Ketten-Reaktion Nicht-quantitative PCRs Semiquantitative radioaktive PCRs Zellkultur-Methoden Kultivierung verschiedener Zellinien Einfrieren und Auftauen von Zellen Ektopische Expression von Proteinen in verschiedenen Zellinien Kalzium-Phosphat-Transfektion von HeLa-Zellen Elektroporation von kultivierten Zellen ß-Galaktosidase-Test Präparation von primären Oligodendrozyten und kortikalen Astrozyten Präparation von Hippocampus-Neuronen der Maus bzw. der Ratte Immuncytochemie Immunfärbung Lebendfärbung von Zellen Färbung von permeabilisierten Zellen Methoden zur Proteinanalyse Herstellung von Zell- und Gewebeextrakten 101

5 V Membranpräparation Gesamtzellextrakte Proteinbestimmung TCA-Präzipitation Proteinanalyse SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Western Blot Analyse Coomassiefärbung von SDS-Polyacrylamidgelen PathDetect Trans reporting system Stratagene in vitro Kinasen-Test Herstellung polyklonaler Antiseren Kopplung des Antigenpeptids Immunisierung Gewinnung und Aufreinigung von Immunseren Analyse der Antikörperbindung (ELISA) Aufreinigung von Antikörpern durch Affinitätschromatographie an Protein A-Sepharose Histologische und immunhistochemische Methoden Ganzkörperfixierung von Mäusen durch Perfusion Immunhistochemie auf Vibratomschnitten Verhaltensbiologie: Rotarod-Test 106 VI. Zusammenfassung 107 VII. Literatur 108