Die Rolle des NLRP3- Inflammasom in der Pathogenese der idiopathischen pulmonalen Fibrose und Sarkoidose

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1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Abteilung für Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Die Rolle des NLRP3- Inflammasom in der Pathogenese der idiopathischen pulmonalen Fibrose und Sarkoidose Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Benedikt Jäger geboren am in Lahr-Schwarzwald Freiburg im Breisgau, Juni

2 III Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis III 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung Spezifische Rezeptoren des angeborenen Immunsystems fördern die Entzündungsreaktionen in den Zellen von Organen des menschlichen Körpers Muster Erkennungs Rezeptoren Pattern Recognition Rezeptoren" Die Toll- ähnlichen Rezeptoren (toll- like receptors; TLRs) Die Nod Like Rezeptor Familie (NLRs) Das Absent In Melanoma 2 Inflammasom (AIM2) Die lnterleukin-1 Familie Regulation der Assemblierung des NLRP3 Inflammasomproteinkomplexes und der daraus folgenden Caspase-1 Aktivierung und IL-1 ß Produktion in Makrophagen Liganden des NLRP3 Inflammasoms bei verschiedenen inflammatorischen Erkrankungen Die Rolle der Mitochondrien in der NLRP3 Inflammasom- Aktivierung Hypothese zur Rolle der Mitochondrien von apoptotischen AEC Typ I Zellen in der Lungenfibrose auf die NLRP3 Aktivierung Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms über Cathepsin B Die Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms über Hyaluronsäure Die MicroRNAs Regulation des NLRP3 Inflammasoms durch microrna-223 (mir-223) Die diffusen Lungenparenchymerkrankungen Die idiopathische pulmonale Fibrose Pathogenese der IPF Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) Die M1 und M2 Alveolarmakrophagen Das Bleomycin- Lungenfibrosemausmodell Bedeutung des NLRP3 Inflammasom im BLM Lungenfibrose Mausmodell Die Sarkoidose Das TDM- Mausmodell Zielsetzung 19 3 Material und Methoden Material Allgemeines Equipment Software Verbrauchsmaterial Chemikalien, Reagenzien und Kulturmedien Puffer und Lösungen Western Blot ELISA Kits, Mastermix Antikörper Größenmarker Stimulanzien und Inhibitoren Primer 30

3 IV Enzyme Experimente mit dem TDM- Mausmodell Methoden Zelluläre Methoden Broncho Alveoläre Lavagen (BAL) Auswahl der Probanden Durchführung der Bronchoskopie mit Lavage Aufarbeitung der Broncho Alveolären Lavage (BAL) Zellzählung in Türklösung Zellkultur und Gewinnung von Überständen Zellstimulationsprotokolle Definition des Inflammasom Stimulationsprotokoll Stimulationen von Alveolarmakrophagen mit 10Gy bestrahlten apoptotischen A549 Zellen Analyse des Einflusses von apoptotischen A549 Zellen, NADPH Oxidase- und Cathepsin Inhibitoren auf die NLRP3 mrna Expression in Alveolarmakrophagen Untersuchung des Einflusses von konditioniertem Medium von 10 Gy bestrahlten apoptotischen A549 Zellen auf die Inflammasom- Aktivierbarkeit von AM Herstellung von bestrahltem konditioniertem A549 Medium und Stimulation der BAL Zellen Untersuchung der Rolle von Hyaluronsäure auf die NLRP3 Aktivierung in Alveolarmakrophagen Verdau der Hyaluronsäure mittels der Hyaluronidase Real Time PCR (Polymerase chain reaction) RNA-Isolation mit Trizol Reverse-Transkription; Umschreiben der RNA in cdna Reaktionsansatz für die Reverse Transkription einer Probe Bestimmung der relativen Expressionsrate von NLRP3 und mirna223 mittels Real-Time PCR Bestandteile des Reaktionsansatzes für die Real-Time PCR am icycler/biorad Auswertung der Real-time PCR Micro RNA-Isolation (mirna) Reverse-Transkription der Micro RNA mit RT Megaplex Primer Human Pool A Reaktionsansatz für die Reverse Transkription einer Probe MiRNA Real-Time PCR mittels des Low Density Taq Man Arrays Real-Time PCR mit spezifischen Primern für mirna-223 und NLRP3 nach dem Protokoll von Franz Bauernfeind Anfügung eines Poly- A- Schwanzes an die isolierte mirna Reverse-Transkription der mirna Relative Quantifizierung von mirna-223 und NLRP3 mittels Real- Time PCR im Light Cycler /Roche Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die PCR im Light Cycler /Roche Enzyme Linked-Immunosorbent Assay (ELISA) Hintergrund des capture ELISA Sandwich ELISA Protokoll Proteinanalyse mittels SDS Gelelektrophorese 43

4 V Proteinfällung aus Inflammasom stimulierten BAL- Zellkulturüberständen Auftrennung der Proteine mittels SDS-Gelelektrophorese Western Blot Blocking Schritt Immundetektion von Proteinen bei der Western Blot Methode Die ECL Methode Die Odyssey Methode Untersuchung der inflammasom- Aktivität auf der Ebene der IL-1 ß Zytokinproduktion von BAL Zellen der mirna-223 KO und WT Mäusen im TDM- Mausmodell Vergleich der Granulombildung in der Lunge des TDM- Mausmodells bei mirna-223 KO Mäusen und WT Mäusen mittels Hämatoxilin Eosin gefärbten Histologieschnitten Western Blot Analyse der Caspase-1 und Caspase-1p10 Proteinexpression in Lungenhomogenat der WT und mirna-223 KO Mäuse im TDM- Mausmodell Proteinisolation aus Mäuselunge Statistische Analysen 47 Resultate Studienpopulation Untersuchungen zur Rolle des NLRP3 Inflammasoms bei der idiopathischen pulmonalen Fibrose Die Stimulation mit LPS+ATP und LPS+Nigericin aktiviert das NLRP3 Inflammasom in AM gesunder Probanden Die Aktivierbarkeit des NLRP3 Inflammasoms ist bei AM von IPF- Patienten signifikant erhöht Die IL-1ß Produktion ist nach NLRP3 Inflammasom Stimulation am höchsten bei AM von Patienten mit einer akuten Exazerbation im Rahmen der IPF und bei AM von ARDS- Patienten Die relative NLRP3 Expression und intrazelluläre pro-il-1ß Protein Expression unterscheidet sich nicht bei AM von IPF- Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden Gesteigerte NLRP3 Inflammasom-Aktivität in AM durch den Kontakt zu bestrahlten, apoptotischen Alveolarepithelzellen Der Zellkontakt von AM zu apoptotischen A549 Zellen triggert die relative NLRP3 Expression via ROS" und Cathepsin B" Konditioniertes Medium bestrahlter apoptotischer Zellen und enzymatisch verdaute Hyaluronsäure triggert in AM signifikant die IL-1 ß Produktion Untersuchung zur Rolle des NLRP3 Inflammasoms und der mirna-223 in AM von Sarkoidose- Patienten und im TDM- Mausmodell Gesteigerte NLRP3 Inflammasom Aktivierbarkeit der AM von Patienten mit einer Sarkoidose im Vergleich zu AM von gesunden Probanden Die intrazelluläre pro-il-1ß Protein Expression ist basal und nach Stimulation mit ATP, Nigericin, und LPS in AM von Sarkoidose- Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden gesteigert AM von Sarkoidose- Patienten besitzen eine signifikant gesteigerte IL-1 ß Produktion nach AIM2 Inflammasom Stimulation im Vergleich zu AM gesunder Probanden 63

5 VI Verstärkte mirna Expression in gesorteten AM gesunder Probanden im Vergleich zu gesorteten Sarkoidose AM Verringerte relative mirna-223 Expression und gesteigerte relative NLRP3 Expression in gesorteten AM von Sarkoidose- Patienten im Vergleich zu gesorteten AM gesunder Probanden AM der mir-223 KO Mäuse haben eine gesteigerte IL-1 ß Produktion im Vergleich zu Wild Typ (WT) Mäuse im TDM- Mausmodell Gesteigerte Granulombildung in der Lunge von mirna-223 KO Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen im TDM-Mausmodell Erhöhte Caspase-1 Protein Expression in Lungenhomogenat von mirna-223 KO Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen im TDM-Mausmodell Diskussion Die Rolle des NLRP3 Inflammasoms bei der idiopathischen pulmonalen Fibrose Gesteigerte Inflammasom- Aktivierbarkeit in AM von Sarkoidose-Patienten Im TDM- Mausmodell weisen mirna-223 KO Mäuse eine erhöhte NLRP3 Aktivität und pulmonale Granulomas auf 80 6 Ausblick 82 7 Literatur 83