Tierärztliche Hochschule Hannover

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten aus Follikeln mit unterschiedlicher Durchblutung der Follikelwand INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet.) vorgelegt von Ana Hanstedt Lüneburg Hannover 2009

2 1 Einleitung 1 2 Literatur Physiologische Grundlagen Der Zyklus des Rindes DieOogenese Präpuberale Entwicklung von Eizellen Postpuberale Entwicklung von Eizellen Die Follikulogenese Allgemeine Follikulogenese Follikuläre Gefäßentwicklung Follikelflüssigkeit Steroidhormone in der Follikelflüssigkeit Östradiolgehalt in der Follikelflüssigkeit Progesterongehalt in der Follikelflüssigkeit Die frühe Embryonalentwicklung Expression von mrna in Oozyten und Embryonen Messenger RNA-Expression spezifischer entwicklungsrelevanter Gene in Oozyten und Embryonen Heat shock protein Zygote arrest genei Growth and differentiation factor Bone morphogenic protein Glukose-Transporter Glukose-Transporteri Glukose-Transporter Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase DNA-Methyltransferasen DNA-Methyltransferase DNA-Methyltransferase Histon-Deacetylase Desmocollin2 44

3 2.2 Gewinnung von KOK für den Embryotransfer durch die transvaginale ultraschallgeleitete Punktion von Follikeln Die Entwicklung des OPU OPU im Vergleich zu anderen Methoden der Eizellgewinnung bzw. Embryonenproduktion beim Rind Vergleich mit der Gewinnung von KOK aus Ovarien vom Schlachthof Vergleich mit der Superovulation und Insemination mit anschließender Spülung des Uterus Einflussfaktoren auf die Ergebnisse des OPU Vergleich unterschiedlicher Zeitintervalle zwischen den OPU-Sitzungen Einfluss des Punktionsintervalls der OPU-Sitzungen auf die Zahl der gewonnenen KOK Einfluss des Punktionsintervalls der OPU-Sitzungen auf die Qualität der gewonnenen KOK Auswirkungen des OPU auf die Spendertiere Auswirkungen der IVP auf das entstehende Individuum Entwicklungskompetenz von KOK Einflussfaktoren auf die Entwicklungskompetenz von Eizellen Parameter zur Einordnung der Entwicklungskompetenz Untersuchungen zur perifollikulären Durchblutung im Zusammenhang mit der Fertilität Untersuchungen am Menschen Untersuchungen am Pferd Untersuchungen am Rind 64 3 Material und Methoden Gewinnung von bovinen Oozyten und Follikelflüssigkeit Tiermaterial Ovum pickup Separation, Klassifizierung der gewonnenen Kumulus-Oozyten- Komplexe und Vorbereitung der Eizellen für die mrna-analsye Gewinnung von Follikelflüssigkeit 75

4 i 3.2 Durchführung der IVP In-vitro-Maturation In-vitro-Fertilisation In-vitro-Kultivierung Auswertung der Teilungs- und Entwicklungsraten Vorbereitung der Blastozysten für die mrna-analyse MessengerRNA-Analyse Aufbereitung der Proben Prewash der Dynabead-Lösung Zelllyse und Extraktion der mrna mit Hilfe der Dynabeads Herstellung komplementärer DNA (cdna) mittels reverser Transkriptase Durchführung der quantitativen PCR Ermittlung der Konzentration von 17ß-Östradiol und Progesteron in der Follikelflüssigkeit Bestimmung der Progesteronkonzentration per ELISA Bestimmung der 17ß-Östradiol-Konzentration mittels Radioimmunoassay Versuchsaufbau Allgemeiner Versuchsaufbau Versuchsanordnung Etablierung von OPU und anschließender IVP Durchführung des Hauptversuchs Statistische Auswertungen 93 4 Ergebnisse Ergebnisse aus dem OPU Ergebnisse zu den punktierten Follikeln Ergebnisse mit Fokus auf das Punktionsintervall zwischen den OPU- Sitzungen Ergebnisse mit Fokus auf den Durchblutungsstatus der Follikel Ergebnisse bezogen auf das Punktionsintervall der OPU-Sitzungen und den Durchblutungsstatus der Follikel 99

5 Ergebnisse zu den gewonnenen KOK Ergebnisse aus der IVP Ergebnisse aus der Analyse der mrna-expression verschiedener Gene Analyse der unreifen Eizellen Analyse der Blastozysten! Ergebnisse aus der Analyse der Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit Diskussion OPU IVP Messenger RNA-Expressionsmuster Follikelflüssigkeit Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Verzeichnis der Medien und Einzeldaten Eingesetzte Medien : Medien für das OPU Medien für die IVP Medien für die RT-PCR Medien für den ELISA Einstellungen des Ultraschallgerätes Einzeldaten aus dem Versuchsteil Einzeldaten aus dem OPU Einzeldaten aus der Bestimmung der Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit Einzeldaten aus der RT-PCR Übersicht über die mrna-gehalte in den untersuchten unreifen Oozyten Übersicht über die mrna-gehalte in den untersuchten Blastozysten Verzeichnis der Abkürzungen 185 IV