Abkürzungsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Einleitung Proteomik Proteom...

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1 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis... 7 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Einleitung Proteomik Proteom Protein-Protein Interaktionen allgemein Methoden zur Analyse von Protein-Protein Interaktionen Strep-tag Hepatoma-derived growth factor (HDGF) Allgemeines HDGF und Proteomik Ziel der Arbeit Material Verbrauchsmaterialien Chemikalien Allgemeine Lösungen und Puffer Chemisch kompetente Zellen Zellkulturmedien Zelllinien Primer Plasmide Antikörper Größenstandards Geräte

2 3 Methoden Molekularbiologische Techniken Allgemeines Isolierung von Plasmid-DNA Präparation von RNA aus Zellen Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Saure Ethanolfällung Spaltung von Plasmid-DNA Auftrennung von DNA in Agarosegelen Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Reverse Transkription Polymerase-Ketten-Reaktion Ligation von DNA-Fragmenten Transformation von Plasmid-DNA in chemisch kompetente Bakterien Zyklische Sequenzierung Quantitative RT-PCR Zellkultur Kultivierung von Zellen Einfrieren und Auftauen von Zellen Teilen von Zellen Zählen von Zellen Transfektion von eukaryontischen Zellen Biochemische Arbeiten Herstellung von Zelllysaten Proteinbestimmung Behandlung von Zelllysaten mit RNAse A

3 3.3.4 SDS-PAGE Blau-Native Gelelektrophorese (BN-PAGE) Western Blot nach dem Semi-Dry Verfahren Coomassie Färbung von SDS-Gelen Immunfluoreszenzfärbung von Proteinen in Zellen Affinitäts-Aufreinigung von Strep-tag Fusionsproteinen Aufreinigung über Strep-Tactin MacroPrep Z-Säulen Aufreinigung über Strep-Tactin Sepharose und MacroPrep Beads Größenausschlusschromatographie Massenspektrometrische Analysen Probenvorbereitung FASP-Methode Nano-LC MS2 Analyse ESI-Ionenfalle Daten-Analyse Ergebnisse Untersuchungen zu HDGF-Proteinkomplexen Untersuchung von HDGF-Proteinkomplexen mittels Größenausschlusschromatographie Untersuchung von HDGF-Proteinkomplexen mittels Blau-Nativer-Gelelektrophorese Aufreinigung der HDGF-Proteinkomplexe über Strep-Tactin Matrizes Identifizierung der Interaktionspartner von HDGF Massenspektrometrische Identifizierung von HDGF- Interaktionspartnern Verifizierung der mit Massenspektrometrie identifizierten Kandidaten mittels Western Blot

4 4.4 Untersuchungen zur Interaktion von HDGF und Nukleolin Immunzytochemische Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von HDGF und Nukleolin Untersuchung der Koreinigung von Nukleolin in Abhängigkeit der HDGF NLS 2-Variante Abhängigkeit der HDGF-Nukleolin-Interaktion von RNA Untersuchungen zum Einfluss von Bcl-2 auf die Interaktion von HDGF und Nukleolin Einfluss der Überexpression von HDGF auf die Expressionshöhe von Bcl-2 auf mrna und Proteinebene Untersuchung der Interaktion von HDGF und Nukleolin in Abhängigkeit verschiedener Bcl-2 Konstrukte in HeLa-Zellen Untersuchung der Zusammensetzung der Eluate von Bcl-2 cds und mrna mit Hilfe der MaxQuant Analyse Interaktions-Muster von HDGF in Abhängigkeit verschiedener Phosphomutanten Diskussion HDGF-Proteinkomplexe Untersuchungen zu HDGF und Nukleolin Untersuchungen zu HDGF und Nukleolin in Abhängigkeit von Bcl Bedeutung der identifizierten Interaktionspartner im Hinblick auf mögliche Funktionen von HDGF Zusammenfassung Literatur Anhang Massenspektrometrie Mascot Report-Listen der identifizierten Proteine aus der tryptischen Spaltung von Proteinen aus SDS-Gelen

5 8.1.2 Mascot Report-Listen der Proteine aus der direkten tryptischen Spaltung von Proteinen der Eluat-Fraktionen Mascot Report-Listen der identifizierten Proteine aus der tryptischen Spaltung von Proteinen aus dem SDS-Gel der Phosphomutanten von HDGF Liste der Proteine aus der Untersuchung der Eluate von HDGF Strep-tag mit Bcl-2 cds und VL in der LTQ-Orbitrap Kontrolle der Gesamt-RNA für die quantitative Real-time PCR Vektorkarten Erklärung Danksagung Lebenslauf