Posttranskriptionale Veränderungen der Genexpression bei hereditären Erkrankungen

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1 Posttranskriptionale Veränderungen der Genexpression bei hereditären Erkrankungen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. des Fachbereichs Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universität Berlin durchgeführt im Labor von Prof. Dr. A. E. Kulozik, PhD, Universitätsklinikum Charité, Berlin von Niels Henrik Gehring aus Berlin Wilmersdorf Berlin und Heidelberg, den

2 1. Gutachter: Herr Prof. Dr. A. E. Kulozik, PhD Universitätsklinikum Heidelberg Kinderklinik, Ärztlicher Direktor Abt. III, Pädiatrische Onkologie und Hämatologie Im Neuenheimer Feld Heidelberg 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. V. A. Erdmann Freie Universität Berlin Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie Institut für Chemie/Biochemie Thielalle Berlin Tag der Disputation:

3 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG Die Bedeutung des humanen Genoms Kontrolle der Genexpression Das Konzept eines regulierten Transkripts Die Blutgerinnung Kontrolle der Blutgerinnung Hereditäre Störungen der Blutgerinnung Nonsens-vermittelter mrna-abbau Modelle des NMD Die Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim NMD Die Komponenten des NMD beim Menschen 25 2 ABKÜRZUNGEN 28 3 MATERIAL UND METHODEN Mikrobiologische Methoden Bakterienstämme Phagen Herstellung elektrokompetenter Bakterien und Elektroporation Kultur eukaryontischer Zellen Transfektion eukaryontischer Zellen BBS/Kalziumphosphat Methode HBS/Kalziumphosphat Methode Plasmid-Konstrukte In vitro Mutagenese PCR in vitro Mutagenese In vitro Mutagenese mit Uracil-haltiger einzelsträngiger DNA Sequenzierung von DNA DNA-Extraktion aus Agarosegelen Plasmid-Präparation im Mini-Maßstab Plasmid-Präparation im Midi-, Maxi- und Mega-Maßstab RNA-Präparation aus eukaryontischen Zellen Präparation von zytoplasmatischer Gesamt-RNA Präparation nukleärer Gesamt-RNA Fraktionierung von zytoplasmatischer Gesamt-RNA in poly(a) -angereicherte und poly(a)-abgereicherte RNA Ribonuklease-Protektions-Analyse RNA-Analyse mittels Northern-Blot In vitro Transkription Primer-Extension-Analyse Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden LM-PAT-Assay RT-PCR 49

4 3.17 Proteinextraktion Proteinbestimmung Immunpräzipitation Protein-Analyse mittels Immunblot Puffer und Lösungen Medien für Bakterienkultur Reagenzien und Materialien Chemikalien Antikörper Laborkunststoffwaren Enzyme 56 4 ERGEBNISSE Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin G>A Mutation Experimentelles System Die F G>A Mutation führt zu erhöhter mrnaund Protein-Akkumulation Die F G>A Mutation erhöht die mrna Expression auf post-transkriptionaler Ebene F2*A und F2*G mrnas weisen identische Poly(A)-Schwänze und 3 UTRs auf Die Mutation F G>A bewirkt eine Erhöhung der 3 End- Prozessierungs-effizienz Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mrna-abbau Experimentelles System Hybrid-mRNAs aus HBB und H1F3 werden korrekt am 3 Ende prozessiert Hybrid-mRNAs bilden funktionelle Histon 3 Enden Demonstration der eisenabhängigen Translationsregulation im experimentellen System Nicht-polyadenylierte Hybrid-mRNAs mit Histon 3 Enden unterliegen dem Nonsens-vermittelten mrna-abbau Die verringerte Expression der Nonsens-mutierten HybridmRNAs ist spleißabhängig Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mrna-abbaus Das experimentelle λn/boxb β-globin-system Untersuchung potentieller NMD-Faktoren Funktionelle Analyse von Deletionsmutanten von hupf3b Punktmutationen im Bereich interferieren mit der NMD- Wirkung von hupf3b Der C-Terminus von hupf3b ist notwendig aber nicht hinreichend um NMD zu vermitteln Die Aminosäuren von hupf3b vermitteln die Interaktion mit Y14 101

5 4.3.7 Y14 ist ein starker Vermittler von NMD Y14 ist ein bona fide Mediator des NMD DISKUSSION Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin G>A Mutation Ein neuartiger Mechanismus einer hereditären Erkrankung Auswirkungen der 3 End-Prozessierungseffizienz auf die Prothrombin-Expression Fazit Ausblick Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mrna-abbau Die Kopplung der Polyadenylierung und anderer RNA-Prozessierungsreaktionen Fazit Ausblick Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mrna-abbaus Charakterisierung von hupf3b-domänen im NMD Identifizierung von Y14 als bona fide NMD-Mediator Fazit Ausblick ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY BIBLIOGRAPHIE 129