Die Initiation der Transkription in den Mitochondrien höherer Pflanzen

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1 Die Initiation der Transkription in den Mitochondrien höherer Pflanzen DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften am Fachbereich Chemie der Freien Universität Berlin vorgelegt von FRANK HATZACK aus Berlin 1996

2 INHALT 1. EINLEITUNG Der evolutionäre Ursprung von Mitochondrien und Chloroplasten Größe und Organisation mitochondrialer Genome Grundzüge der Transkription in den Mitochondrien von Vertebraten Mitochondriale Promotorstrukturen und Transkriptionsfaktoren in Vertebraten Mehrere Promotoren im mitochondrialen Genom von Saccharomyces cerevisiae Spezifische Initiation in Saccharomyces cerevisiae: sc-mttfb fungiert analog zu eubakteriellen o-faktoren Sc-mtTFA hat eine histon-ähnliche" Funktion in Saccharomyces cerevisiae Konservierte Sequenzmotive umgeben Transkriptionsstartpunkte in mitochondrialen Genomen höherer Pflanzen Ziele der Arbeit MATERIAL Versuchspflanzen Bakterienstamm Feinchemikalien Radiochemikalien DNA-modifizierende Enzyme Nukleinsäuren Kits Autoradiografie Elektrophoresekammern Chromatographie und Ultrafiltration Geräte Puffer und Lösungen 17

3 3. METHODEN Standardmethoden Erzeugung von Deletionsklonen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion Präparation radioaktiv markierter DNA-Proben Isolierung von Mitochondrien aus Erbsensprossen Aufreinigung eines transkriptionsaktiven Proteinlysats aus Erbsenmitochondrien Solubilisierung von Mitochondrien Ammoniumsulfatfraktionierung Anionen-Austauschchromatographie auf der MonoQ-Säule In vitro Transkriptionstest Isolierung radioaktiv markierter Nukleinsäuren aus Polyacrylamidgelen Primer-Extension-Analyse Aufreinigung DNA-bindender Proteine aus Erbsenmitochondrien unter denaturierenden Bedingungen Denaturierende Lyse von Mitochondrien Chromatographie an Hydroxylapatit Renaturierung von Proteinen durch Triton X Kationen-Austauschchromatographie auf Phosphocellulose Reversed-Phase-HPLC Methoden zum Nachweis von DNA-Protein-Interaktion Mobiüty-Shift-Analyse UV-Crosslink-Analyse Bestimmung relativer Bindungsaffinitäten Quantifizierung von DNA-Bindungsaktivität Größenbestimmung DNA-bindender Proteine durch Geldissektion Detektion radioaktiver Signale durch Phosphoimage-Analyse 37

4 4. ERGEBNISSE Ein in vitro Transkriptionssystem für Mitochondrien dikotyledoner Pflanzen Auswahl der DNA-Templates und des geeigneten Pflanzenmaterials Isolierung eines transkriptionsaktiven Proteinextrakts aus Erbsenmitochondrien Detektion der spezifischen Transkriptionsaktivität Die Transkription des atp9 Gens aus Erbse wird in vitro am Nonanukleotidmotiv initiiert Spezifische Initiation der Transkription an heterologen Promotoren Promotoren aus Sojabohne Promotoren aus Oenothera berteriana In vitro Transkription eines trna Promotors Feinkartierung von in vitro Transkriptionsstartpunkten Deletionsanalyse des atp9 Promotors aus Erbse Entwicklung einer Aufreinigungsstrategie für DNA-bindende Proteine aus Erbsenmitochondrien Option für ein Verfahren unter denaturierenden Bedingungen Die Aufreinigungsmethode umfaßt drei chromatographische Schritte Detektion von DNA-Bindungsaktivität Identifizierung DNA-bindender Proteine Das 44 kda Protein Das 32 kda Protein Die Aufreinigungseffizienz der entwickelten Methode Promotorspezifische DNA-Bindung Proteinbindung in verschiedenen Abschnitten zweier heterologer Promotorregionen Diearp9 Promotorregion aus Erbse Die afp 1 Promotorregion aus Oenothera 76

5 4.12. Konservierte Sequenzelemente sind entscheidend für die Bindung des 32 kda Proteins Das 32 kda und das 44 kda Protein sind in transkriptionsaktiven Proteinfraktionen enthalten Die Zugabe beider Proteine führt zu einer erhöhten Transkriptmenge in vitro DISKUSSION Initiation der Transkription in vitro: Die Funktion des Nonanukleotidmotivs wird bestätigt Andere Promotortypen in den mitochondrialen Genomen von Pflanzen? Die minimalen Promotorregionen von atp9 aus Erbse und atp\ aus Mais haben einen ähnlichen Aufbau Biochemische Eigenschaften von DNA-Bindungsproteinen aus Erbse im Vergleich zu denen von mttfa-proteinen Zwei benachbarte Proteinbindungsstellen in den Promotorregionen von atp9 aus Erbse und atpl aus Oenothera Erhöhte Transkriptmengen als Indiz für eine Stimulation der Transkriptionsinitiation Unterschiedliche DNA-Bindungseigenschaften weisen auf verschiedene Funktionen der identifizierten Proteine hin Ein mflhs-ähnliches Protein in Mitochondrien höherer Pflanzen? Die Transkriptionsinitiation in den Mitochondrien von Pflanzen, Vertebraten und Saccharomyces cerevisiae: Gemeinsamkeiten und Unterschiede ZUSAMMENFASSUNG. 7. LITERATUR 100