Inhaltsverzeichnis. Abbildungsverzeichnis. Tabellenverzeichnis. Abkürzungsverzeichnis

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Manuela Lenz
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1 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis vi viii ix 1. Einleitung Phage Display Phage-Display-Bibliothekenformate Biopanning Interaktionsstudien Surface Plasmon Resonance Bovine pancreatic trypsin Inhibitor (BPTI) Motivation für diese Arbeit Zielstellung Material und Methoden Mikrobiologische Methoden Puffer und Medien E.coli TG Stammkonservierung Kultivierung Infektion von E.coli TG1 mit Bakteriophagen Zellernte Wachstumskinetiken Phagenbibliotheken Reamplifikation des Helferphagen VCSM Generierung einzelner Plaques i

Bovine pancreatic trypsin Inhibitor (BPTI)................. 8 1.4. Motivation für diese Arbeit......................... 10 1.5. Zielstellung................................. 11 2.

2 Amplifikation der Heferphagen Amplifikation von Phagen der ETH-2-Bibliothek Amplifikation von Phagen der Peptidbibliotheken Phagenernte Titerbestimmung der Helferphagen Bestimmung des Titers von Phagen der ETH-2 sowie der Peptidbibliotheken Diversitätsbestimmung Lagerung von Phagen Anreicherung spezifischer Phagen - Immunotubes Beschichten von Immunotubes Präabsorption der Phagenpopulationen Phagenanreicherung mittels Panning Anreicherung spezifischer Phagen - Biacore Definition monoklonale/polyklonale Phagen Molekularbiologische Methoden Isolierung von Plasmid-DNA Kolonie-PCR Aufreinigung von PCR-Fragmenten Gelelektrophorese Sequenzierung Trypsinaktivitätstest - Bestimmung BPTI-Stabilität Analytische Methoden Bestimmung der optischen Dichte von E.coli-Kulturen Photometrische Konzentrationsbestimmung von Peptiden in Lösung Messung bei 280 nm Messung bei 205 nm Massenspektrometrie Phagen-ELISA Polyklonaler Phagen-ELISA Chessboard-ELISA Monoklonaler Phagen-ELISA Proteininteraktionsstudien Surface Plasmon Resonance (SPR) ii

Diversitätsbestimmung....................... 19 2.1.11. Lagerung von Phagen....................... 19 2.1.12. Anreicherung spezifischer Phagen - Immunotubes......... 19 2.1.12.1. Beschichten von Immunotubes.

3 Chemikalien und Lösungen Präparation eines CM5-Chips mithilfe eines Amine Coupling Kits Bestimmung der maximalen Bindekapazität SPR-Messungen Auswertung der Ergebnisse Affinitätschromatographie Präparation der Säulen Bodenzahlbestimmung und Peaksymmetrie Durchführung/Methode Fluoreszenzspektroskopie Fluoreszenzspektren Fluoreszenztitration Peptidchemie Festphasenpeptidsynthese Chemikalien und Lösungen Peptidpropagation Kaiser Test Abspaltung vom Harz Aufreinigung mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Vorarbeiten / Etablierung Wachstumskinetik E. coli TG Kultivierungsparameter Temperatur und Glukosegehalt zur Produktion von fd-phagen Etablierung Insert-PCR für Peptidbibliotheken Etablierung Phagen-ELISA Stabilität BPTI scfv als Interaktionspartner photomodulierbarer Peptide Einleitung Die ETH-2-Phagenbibliothek im scfv-format Screening der scfv-bibliothek iii

4.2.1. Präparation der Säulen.................. 31 2.4.2.2. Bodenzahlbestimmung und Peaksymmetrie....... 32 2.4.2.3. Durchführung/Methode................. 33 2.4.3. Fluoreszenzspektroskopie..................... 33 2.4.3.1. Fluoreszenzspektren.

4 Vorbereitung Screening nach einem scfv-antikörperfragment mit Spezifität gegen ein photosensitives FLAG-Analog Auswertung der Ergebnisse Selektion und Charakterisierung von BPTI-Liganden im Peptidformat Einleitung Screening der 20-AS-Bibliothek nach BPTI-Liganden Selektionsrunden Selektionsrunden 4 und Herstellung und Charakterisierung der Peptide 53 und Peptidsynthese Affinitätschromatographie Aufreinigung von Peptiden mittels Umkehrphasen-HPLC Bindungsstudien der Peptide 53 und Bestimmung der Dissoziationskonstanten mittels Surface-Plasmon- Resonance (SPR) SPR: Kopplung des Liganden BPTI an einen Sensorchip SPR: Massentransferlimitierung SPR: Bestimmung der Dissoziationskonstanten Bestimmung der Dissoziationskonstante mithilfe von Fluoreszenztitration Fluoreszenzspektren Fluoreszenztitration Ausschluss des Peptides Peptid 53 als Ligand in einer Chromatographiesäule Identifizierung bindungsrelevanter Aminosäuren des Peptides Screens der (NNK) 15 und Cys-(NNK) 20 -Cys Peptidbibliotheken Synthese und Charakterisierung des mehrfach aus der (NNK) 15 -Bibliothek isolierten Peptides Vergleich der Screens und Peptide der (NNK) 20 - (NNK) 15 und Cys-(NNK) 20 -Cys Peptidbibliotheken Synthese und Charakterisierung verkürzter Peptide Zusammenfassung iv

.......... 55 5.2.1. Selektionsrunden 1-3........................ 55 5.2.2. Selektionsrunden 4 und 5...................... 57 5.3. Herstellung und Charakterisierung der Peptide 53 und 54......... 60 5.

5 6. BPTI-Liganden im scfv-format Screening nach einem scfv-antikörperfragment mit Spezifität gegen BPTI Charakterisierung von scfv nach Biopanning Alternative Selektionsverfahren für Biopanning 4 und Sequenzvergleich von scfv nach Biopanning 4 und Evaluierung polyklonaler und monoklonaler Phagen nach den verschiedenen Panningrunden Design eines linearen Peptides basierend auf den CDRs eines Single- Chain Antikörpers in silico Modellierung der Interaktionen Mimotop-BPTI Docking-Studie Peptid 69 - BPTI Docking-Studie des Peptides 70 - BPTI Zusammenfassung Ausblick 103 A. Anhang 105 A.1. Ergänzung Material und Methoden A.1.1. verwendete Primer A.1.2. DNA-Größenstandard A.2. Ergänzung Ergebnisse A.3. Lebenslauf Anhang 105 Literaturverzeichnis 117 v

.................... 91 6.2. Design eines linearen Peptides basierend auf den CDRs eines Single- Chain Antikörpers............................. 94 6.3.

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