Pharmakologische Untersuchungen zur Neuropeptid Y Yi-, Y 2 - und Ys-Rezeptorselektivität peptidischer und nichtpeptidischer Liganden:

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Katja Gerstle
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1 o Pharmakologische Untersuchungen zur Neuropeptid Y Yi-, Y 2 - und Ys-Rezeptorselektivität peptidischer und nichtpeptidischer Liganden: Klonierung und funktioneile Expression des humanen Ys-Rezeptors in HEG-1-B-Zellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV - Chemie und Pharmazie - der Universität Regensburg vorgelegt von Christiane Moser aus Speyer 1999

2 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG NPY-Rezeptorsubtypen NPYYi-Rezeptor NPY Y 2 -Rezeptor NPY Y 3 -Rezeptor NPY Y 4 -Rezeptor NPY Y 5 -Rezeptor NPY y«-rezeptor Beteiligung von Neuropeptid Y an der Regulation der Nahrungsaufnahme Probleme beim Einsatz von Assays mit rekombinanten Rezeptoren 14 2 PROBLEMSTELLUNG 16 3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION Expression des Neuropeptid Y Y2-Rezeptors Auswahl und Transfektion geeigneter Zellen Überprüfung der Y2-Rezeptorexpression mit Radioligand-Bindungsversuchen Kopplung des NPY Y2-Rezeptors an Ca 2+ -Signaltransduktionswege Kopplung des NPY Y2-Rezeptors an die Adenylylcyclase Expression des Neuropeptid Y Y,t-Rezeptors PCR-Klonierung und Sequenzierung der menschlichen NPY Y4-Rezeptor-DNA Auswahl einer geeigneten Zelllinie und Transfektionsmethode Radioligand-Bindungsversuche Versuche mit der Zelllinie PC Expression des Neuropeptid Y Ys-Rezeptors PCR-Klonierung und Sequenzierung der menschlichen NPY Y 5 -Rezeptor-DNA Auswahl einer geeigneten Zelllinie 33 I

3 3.3.3 Auswahl einer geeigneten Transfektionsmethode Immunfluoreszenz-Detektion des NPY Ys-Rezeptors Optimierung der transienten Transfektion von HEC-1-B-Zellen mit dem pcdna3-y 5 -FLAG-Vektor und FuGENE Pharmakologische Charakterisierung des transient exprimierten Ys-Rezeptors Stabile Expression des humanen NPY Y 5 -Rezeptors in HEC-1-B-Zellen Pharmakologische Charakterisierung des stabil exprimierten Ys-Rezeptors Chromosomenanalyse Funktionalität des Y 5 -Rezeptors im camp-assay Optimierung der Versuchsbedingungen camp-assay mit transient transfizierten HEC-1-B-Zellen camp-assay mit stabil transfizierten HEC-1-B-Zellen Kopplung des NPY Y 5 -Rezeptors an Ca 2+ -Signaltransduktionswege Einfluss von Kationen auf die Radioligand-Bindung am Yi-Rezeptor Ergebnisse der pharmakologischen Untersuchung neuer Neuropeptid Y- Rezeptorliganden Entwicklung von Neuropeptid Y Yi-Antagonisten Strukturklasse der (R)-N a -Diphenylacetylargininanüde (R)-N a -Diphenylacetylargininamide: Korrelation der Ergebnisse aus funktionellen Untersuchungen und Radioligand-Bindungsstudien Argininamide mit verschiedenen N a -Substituenten Rezeptorsubtypselektivität der Argininamide Pharmakologische Testung von Referenzsubstanzen als NPY Yi-Antagonisten Ergebnisse der Untersuchungen am Y2-Rezeptormodell Ergebnisse der Untersuchungen am Ys-Rezeptormodell 87 4 ZUSAMMENFASSUNG EXPERIMENTELLER TEIL Allgemeines Bezeichnungen und Definitionen pharmakologischer Kenngrößen 95 II Software Geräte Verbrauchsmaterial Substanzen, Enzyme, Kits und Reagenzien Peptide Medien, Stammlösungen und Puffer Medien ' Puffer- und Stammlösungen Puffer- und Stammlösungen für die Zellkultur Puffer für die Molekularbiologie Puffer- und Stammlösungen für die Radioligandbindung Reagenzien für die Bestimmung von 3',5'-cAMP Puffer- und Lösungen für die Bestimmung der intrazellulären Ca 2+ - Konzentration Organismen Escherichia coli Stämme Zelllinien Primersequenzen Plasmide Das pef-bos-cs-plasmid Expressionsvektoren pcdefl und pcdef Die Expressionsvektoren pcdna3 und prc/cmv Das pcmx-pl2-plasmid Der phook -l-vektor Allgemeine molekularbiologische Methoden Kultivierung und Aufbewahrung von Bakterien Plattenkulturen Flüssigkulturen Glycerinkulturen Trübungsmessung Herstellung kompetenter E. coli Stämme CaClj/MgCb-Methode 111 m

4 TSS-Methode (Transformation und Storage Solution) Transformation von kompetenten E. coli Bakterien Präparation von Plasmid-DNA Isolierung von DNA durch alkalische Schnelllyse (Miniprep) Isolierung von DNA über Qiagen-Säulen (Maxiprep) Photometrische DNA-Konzentrations- und Reinheitsbestimmung Restriktionsverdau Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Agarose-Gelelektrophorese DNA-Extraktion aus Agarosegelen Verwendung des GENECLEAN II Kits Verwendung des QIAEXII Kits Fällung von DNA Dephosphorylierung von Vektoren Ligation von DNA-Fragmenten Automatische DNA-Sequenzierung Klonierung der Neuropeptid Y Yj-Rezeptor-DNA Klonierung der NPY Y 4 -Rezeptor-DNA aus dem prc/cmv- in den pcdef3-vektor Enzymatische Modifikation der Vektor-DNA Enzymatische Modifikation der Insert-DNA Ligation Kontrolle des pcdef3-y 4 -Konstrukts Klonierung der NPY Y 4 -Rezeptor-DNA in den pcdef3-vektor nach Sequenzanalyse PCR zur Amplifikation der humanen NPY Y 4 -Rezeptor-DNA Enzymatische Modifikation der Vektor-DNA Enzymatische Modifikation der Insert-DNA Ligation Kontrolle des pcdef3-y 4 -Konstrukts Klonierung der Neuropeptid Y Y 5 -Rezeptor-DNA Isolierung von menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes 120 IV Reverse Transkription PCR zur Amplifikation der humanen NPY Y 5 -Rezeptor-DNA Klonierung des pcmx-flag-y 5 -PL2-Vektors Klonierung des pcdna3-flag-y 5 -Vektors Klonierung der pcdna3-y 5 - und pcdef3-y 5 -Vektoren Zellbiologische Methoden Kultivierung von Zellen als Monolayer- und Suspensionskultur Einfrieren und Auftauen von Zellen Karyotypisierung Chromosomenpräparation Chromosomenzählung Ermittlung der Geneticinsensitivität Transfektion von eukaryotischen Zellen Calciumphosphat-vermittelte Transfektion Calciumphosphat-vermittelte Transfektion in HBS Glycerinschock Calciumphosphat-vermittelte Transfektion in BBS Transfektion mittels Liposomen Transfektion mit DOTAP-Liposomen Transfektion mit DOSPER-Iiposomen Transfektion mit FuGENE Vergleich verschiedener Transfektionsmethoden für MDA-MB-231 und HEC-1-B-Zellen Optimierung der transienten Transfektionsbedingungen der HEC-1-B-Zellen mit dem pcdna3-y 5 -FLAG-Plasmid und FuGENE Etablierung stabil transfizierter Zelllinien Immunfluoreszenz-Detektion des FLAG-Epitops Radioligand-Bindungsstudien Bindungsstudien an Membranen Membranpräparation Proteinbestimmung nach Bradford Bindungsassay an Membranen 133 V

5 Radioligand-Bindungsassay an Zellen Beurteilung der Transfektionseffizienz Screening von Klonen mit stabiler Neuropeptid Y-Rezeptorexpression Bestimmung des K D -Wertes Berechnung von Ko-Werten Berechnung von IC 5 o-werten Berechnung von Kj-Werten Assay zur Bestimmung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in Zellen Geräteeinstellungen Vorbereitung der Zellen Durchführung des Screenings von NPY-Antagonisten Kalibrierung und Berechnung des [Ca 2+ ]j-anstiegs Aufnahme von Konzentrations-Wirkungs-Kurven Berechnung von EC50-Werten aus Konzentrations-Wirkungs-Kurven Bestimmung von pkß-werten Berechnung von pkß-werten Berechnung von ICso-Werten Assay zur Bestimmung der 3',5'-cAMP-Konzentration in Zellen Versuchsprinzip Stimulation der Zellen Probenaufbereitung Durchführung des camp-assays Geräteeinstellungen Berechnungen Berechnung des camp-gehaltes Berechnung der prozentualen Hemmung der camp-bildung LITERATURVERZEICHNIS 145 VI

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