Grundlegende Methoden der Molekularen Biologie, AD I. Prof. Dr. Albert Duschl

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1 Grundlegende Methoden der Molekularen Biologie, AD I Prof. Dr. Albert Duschl

2 Molekulare Mechanismen Themen für die erste Vorlesung: Signalwege, am Beispiel von Jak/STAT Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz Western Blot, incl. phospho-spezifischer Antikörper, knock-down Reportergene, transient vs. stabil Reporterproteine, LUC, GFP, RFP HTS, single cell analysis, drug development, wie kommt man zu Geld? Unser Beispiel: Schwangerschaftstest Themen für die zweite Vorlesung: Signalwege, am Beispiel von ras/raf/erk Expression, Überexpression Tests für Proliferation, Vitalität, Nekrose, Apoptose Toxizität und Immuntoxizität, wie kommt man zu Geld? Unser Beispiel: Nanotoxikologie Bei wem kommt man zu Geld? Unser Beispiel: FWF

3 Cytokinrezeptoren Cytokinrezeptoren sind oft Dimere. Signalübertragung über die Membran erfolgt durch ligandenabhängige Dimerisierung. Manchmal gibt es eine dritte Untereinheit um die Bindungsaffinität zu verbessern. TNF-Rezeptoren sind Trimere, weil TNF ein Trimer ist. Die Cytokinrezeptor Typ 1 Familie hat konservierte Cysteine und ein WSXWS-Motiv, die in Typ 2 fehlen. Beide Typen haben mindestens zwei Domänen mit Fibronectin Typ III- Fold, einer Variante der Immunglobulin-Superfamilie.

4 Jak Durch die Dimerisierung kommen intrazellulär rezeptorassoziierte Signalmoleküle in Kontakt und aktivieren sich gegenseitig. Im Fall von Cytokinrezeptoren sind Tyrosin-Kinasen vom Jak-Typ dafür verantwortlich. Es gibt vier davon: Jak1, Jak2, Jak3 und Tyk2. Jaks phosphorylieren 1. Das andere Jak Protein 2. Den Rezeptor 3. Stat Faktoren 4. Weitere Proteine, z.b. andere Kinasen

5 STAT STATs sind gleichzeitig Signalübertragungsmoleküle und Transkriptionsfaktoren (Signal Transducer and Activator of Transcription). Es gibt sieben Stats: STAT1, 2, 3,4, 5a, 5b und 6. Stat bindet an den phosphorylierten Rezeptor und wird dort von den Jaks phosphoryliert. Aktiviertes (phosphoryliertes) Stat bildet Dimere, die in den Kern wandern. Dimeres Stat bindet an DNA und wirkt als Transkriptionsfaktor im Promotor von Zielgenen.

6 IL-31: IL-31Ra/OSMRb IL-31 signalisiert über einen Heterodimer. Frage 1: Warum gibt es für IL-31Ra fünf Isoformen, die alle exprimiert werden? Frage 2: Wie wirkt IL-31 in dendritischen Zellen, nachdem es Verbindungen mit Typ 1 und mit Typ 2 Entzündungen aufweist? Elisabeth Maier, unpubliziert

7 Zu Frage 1: Isoform 1 und 2 vermitteln eine vollständige Signalübertragung, d.h. Jak/STAT und weitere Signalwege, die über Phosphotyrosin angestoßen werden, darunter ERK Aktivierung. Isoform 3 und 4 vermitteln ebenfalls Jak/STAT Aktivierung, allerdings in geringerem Ausmaß. Das ist glaubhaft, weil sie auch box 1 und box 2 besitzen, Motive, die für Jak Bindung wichtig sind. Als Andockstellen für STATs stehen in diesem Fall jedoch nur die Tyrosinreste der OSMRb-Kette zur Verfügung. Isoform 5 muss als Orphan-Rezeptor aufgefasst werden und dürfte auch eine Waise bleiben, weil eine Signalsequenz und eine der ligandenbindenden Domänen fehlt. Aber Achtung: HER2 (= ErbB2) ist auch ein Orphan Rezeptor! Methoden u.a. modc Differenzierung, IP, IF, WB, qrt-pcr, EMSA, ChIP, sirna, mediator release. Wir werden uns hier nur um die unterstrichenen kümmern. Elisabeth Maier, unpubliziert

8 modc DC sind 1) Sensoren für Non-Self, 2) Signal-Modulatoren, die Peptidfragmente in MHC II präsentieren, 3) T-Zell Aktivatoren, die zentrale Co- Rezeptoren exprimieren und 4) sie beeinflussen die Differenzierung von T-Zellen. Problem: Sie sind nicht leicht zugänglich. Lösung 1: Menschliche Zell-Linien Lösung 2: Differenzierung aus Monozyten im Blut mit GM-CSF und IL-4. Lösung 3: Sorting von primären DC aus Blut. Für praktische Zwecke ist oft Lösung 2 die beste. Collin et al. Nat Rev Immunol. 11: (2011)

9 Antikörper Kaufen Sie normalerweise. Wichtig ist wofür sie ihn benötigen: Western Blot, Immunpräzipitation, ELISA, Flow cytometry, Immunfluoreszenz und Immuncytochemistry wären häufige Anwendungen. Nicht jeder AK kann alles! Denken Sie daran, dass Sie Kontroll-AK und oft auch sekundäre AK brauchen. Je nachdem werden Sie pro AK gewöhnlich ausgeben müssen. Im folgenden verwendet: FAB2769P R&D Systems, screenshot

10 IL-31Ra Nachweis FACS zeigt uns, dass IFN-g (ein klassisches T H 1 Cytokin) IL-31Ra in modc und in primären DC hochreguliert, während mit OSMRb nicht viel geschieht. Für modc (Fig. B) und pdc (Fig. C) liegt das zeitliche Maximum für die mrna Expression, bestimmt durch PCR, zeitlich vor dem Maximum der Expression an der Oberfläche. Das würden wir auch so erwarten. Beachten Sie, dass in diesem Experiment per FACS nicht unterschieden werden kann, welche Isoformen vorliegen. Auch die PCR ist hier so gewählt, dass sie das nicht tut. Eine PCR mit anderen Primern zeigt aber, dass kurze wie lange Isoformen hochreguliert werden. Horejs-Höck et al. J. Immunol. 188: (2012)

11 Regulation durch IFN-g Der IFN-g Rezeptor ist ein klassischer Cytokinrezeptor der Jak/STAT verwendet. Nach Stimulierung der Zellen mit IFN-g erhalten wir in der Tat phosphoryliertes STAT1, 3 und 5. Beachten Sie, dass wir hier einen Western Blot vor uns haben, in dem teils Antikörper verwendet wurden, die nur phosphoryliertes STAT erkennen. Der Nachweis der Antikörperbindung erfolgt über einen Lumineszenztest und Belichtung eines Films. Der Versuch ist eine wichtige Kontrolle aber wir lernen noch nicht sehr viel. Die drei STATs sind als Targets des IFN-g Rezeptors bekannt. Ohne solche Kontrollen können Sie aber nichts publizieren: Jeder Referee würde so etwas verlangen. Horejs-Höck et al. J. Immunol. 188: (2012) Thermo Fisher Scientific

12 Knockdown Promotoranalyse identifizierte eine STAT1 Bindungsstelle, komplett mit IFN-g abhängiger Bindung. Jetzt muss allerdings gezeigt werden, dass sich dadurch IL-31Ra Expression verändert. Das tut sie (B). Erreicht wurde das mit einem Knockdown von STAT1 durch Transfektion mit einer sirna, die zum Abbau der STAT1 mrna führt. Eine Kontroll-siRNA mit falscher Sequenz hat keine Wirkung, ERK als Ladekontrolle ist unbeeindruckt (A) und auch für STAT 3 und 5 ändert sich nichts (B). ELISA des Zellüberstands zeigt, dass IL-31 die Expression von IL-6, IL-8, CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, TNF-a und CCL22/MDC steigert, nicht aber die von IL-12 oder CCL17/TARC. Ergo, es ist keine allgemeine Erhöhung der Proteinsynthese. Horejs-Höck et al. J. Immunol. 188: (2012)

13 Promotor-Analyse Schönes Beispiel: Der IL-31 Promotor enthält potenziell eine NF-kB und zwei STAT6 Bindungsstellen. Gel-Shift Assays zeigen, dass sie auch verwendet werden. Als Proben werden 32 P-markierte Oligos verwendet, oder Kontrollen dafür. Bei Inkubation mit Kernextrakten IL-33- oder IL-4-stimulierter Zellen bilden sich Komplexe mit NF-kB Untereinheiten, bzw. mit STAT6 (aber nicht STAT5). Für NF-kB erhalten wir mit einem anti-p65 Antikörper einen schönen Supershift und für STAT6 ebenso für die proximale Bindungsstelle. Die distale Stelle zeigt immerhin eine leichte Abschwächung. Maier et al., J. Immunol. 193: (2014)

14 Promotor-Analyse 2 Transiente Transfektion mit Luciferase Reportergenen zeigt, dass der Minimalpromoter für die Regulierung ausreicht. Mutationen in den Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren zeigen die Bedeutung der Sites. LUC ist hier der Reporter. Weibchen des Großen Leuchtkäfers (Lampyris noctiluca), Wikimedia Commons Maier et al., J. Immunol. 193: (2014)

15 LUC Assay Anderes Beispiel: STAT6 bindet an DNA Sequenzen mit dem Konsensus TTCNNNNGAA. Reportergene unter Kontrolle geeigneter Bindungsstellen erlauben es, die transkriptionelle Aktivität von STAT6 in lebenden Zellen zu verfolgen. Dieser Ansatz ist zur Promotoranalyse geeignet, aber auch zur Suche nach potentiellen Hemmstoffen in High Throughput Screening (HTS). Vorteil von LUC ist die enorme Sensitivität. Ein Nachteil ist, dass Sie die Zellen lysieren müssen, Sie verlieren sie also. Sorting wäre nicht möglich. Hebenstreit et al., Cytokine Growth Factor Rev. 17: (2006) A. Duschl steinzeitliche Technik, heute machen wir das viel besser

16 Green Fluorescent Protein Green Fluorescent Protein kann allein durch seine Struktur auf der Basis von aromatischen Aminosäureresten im UV-Bereich absorbieren und fluoresziert dann grün. Das Beispiel rechts unten zeigt eine einzelne Lungenepithel-Zelle, die GFP exprimiert. Es stammt ursprünglich aus einer Qualle. Weniger empfindlich als LUC, aber erlaubt Einzelzell- Analyse und die Zellen überleben, Sie können also sorten oder Kinetiken aufnehmen. Aequorea victoria, Wikimedia Commons Top figure Wikipedia Bottom figure: Kohl et al., Nanoscale Research Letters 6:505 (2011)

17 uninduced Schneller A549 Test Aniela Sommer and Isabella Radauer-Preiml, unpubliziert Red Fluorescent Protein, eine Mutante von GFP (YFP gäbe es auch), hier exprimiert in Lungenepithelzellen. Vorteil von RFP: Geringere Eigenfluoreszenz der Zellen in diesem Bereich, daher ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis. Stabile Transfektion, d.h. 6 Monate Arbeit vor allem mit Geneticin (G418) Selektion. Die Zellen haben Sie dann aber solange Sie wollen. Induced with 20 ng/ml TNF-α 17

18 Schwangerschaftstest Ganz ganz früher: Arzt. Ganz früher: Apotheke. Früher: Chemie für zuhause. Heute: Urin-Schnell-Test. Nachgewiesen wurde immer das gleiche, das Schwangerschaftshormon Chorionic Gonadotrophin (hcg). Was man heute verwendet sind Lateral Flow Tests, z.b. auf Nitrozellulose, Migration von Nanopartikelmarkierten anti-hcg Antikörpern, 1. Capture mit einem zweiten anti-hcg Antikörper, und 2. Capture mit einem anti-maus Antikörper in der Kontrollzone. Das Problem des Schwangerschafts- Nachweises war mit jedem Schritt gelöst. Sie können Geld machen, wenn Sie ein gelöstes Problem besser lösen. Martin Brändli under Creative Commons

19 Geld Die schönste Methodik nützt Ihnen nichts, wenn Sie sie nicht zahlen können. Von den vorgestellten Reagenzien ist keines umsonst, außer menschlichen Blutzellen, und deren Bearbeitung ist schon wieder teuer.