antimikrobielle Barriere

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1 Die intestinale Mukusschicht als antimikrobielle Barriere Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) Fakultät Naturwissenschaften Universität Hohenheim Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft Fachgebiet Biochemie der Ernährung Universität Hohenheim Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie Robert-Bosch-Krankenhaus, Stuttgart vorgelegt von Lena Antoni aus Gräfelfing 2012

2 INHALTSVERZEICHNIS I. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS I II. ABBILDUNGSVERZEICHNIS III III. TABELLENVERZEICHNIS VI IV. ZUSAMMENFASSUNG VII V. ABSTRACT IX 1. EINLEITUNG Allgemeines ' 1.2 Abwehrmechanismen der intestinalen Mukosa Spezifische Abwehrmechanismen Unspezifische Abwehrmechanismen Die zentrale Rolle des Epithels in der intestinalen Abwehr Antimikrobielle Peptide _ Überblick Defensine 6 a) Oberblick 6 b) Alpha-Defensine 7 c) Beta-Defensine 8 d) Regulation der Defenstnexpression und nicht-antimikrobielle Funktionen von Defensinen Cathelicidine Antimikrobielle Peptide im Intestinaltrakt 10 a) Antimikrobielle Peptide im Dünndarm 10 b) Antimikrobielle Peptide im Dickdarm '' 1.4 Die intestinale Mukusschicht Aufbau und Funktion I' Die Familie der Müzine Das sezemierte Muzin MUC Chronisch entzündliche Darmerkrankungen Krankheitsbild Die Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen 16 a) Allgemeines 16 b) Die Rolle der Darmflora in der Pathogenese von CED 17 c) Defekte der intestinalen Mukosabarriere bei CED Zielsetzungder Arbeit MATERIAL Chemikalien und Reagenzien Verbrauchsmaterialien Geräte Kits Rekombinantc Peptide Antikörper 32

3 2.7 Mikroorganismen METHODEN 35 Teil A: Mukosa AI: Methodenetablierung A2: Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukosa des Dickdarms 3.A2.1 Probenmaterial 35 3.A2.2 Aufarbeitung der Proben 35 a) Proteinextraktion 35 b) Gewebefixierung 36 3.A2J Proteinkonzentrationsbestimmung mit der Bradford-Methode 36 3.A2.4 Fraktionierung der Proteinextrakte mittels RP-HPLC 37 3.A2.5 WeitereCharakterisierung der HPLC-Fraktionen 39 a) Durchflusszytometrie 39 b) Coomassie-Färbung von Proteingelen 40 c) Matrixassistierte Laserdesorption/Ionisations time-of-flight Massenspektrometrie 41 d) Dot Blot-Analysen 43 3.A2.6 Immunhistochemie 44 Teil B: Mukus Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukusschicht des Dickdarms 3.B.1 Probenmaterial 44 3.B.2 Aufarbeitung der Proben 45 3.B.3 Proteinkonzentrationsbestimmung 46 a) Proteinkonzentrationsbeslimmung mit derbicinchoninsaure-melhode 46 b) Proteinkonzentrationsbestimmung mit der Lowry-Methode 46 3.B.4 Beta-Aktin-Bestimmung 47 3.B.5 Analyse der antimikrobiellen Aktivität von Mukus-Proteinextrakten 48 a) Fluoreszenzmikroskopie 48 b) Durchflusszytometrie 49 3.B.6 Experimente zur Bindung von antimikrobiellen Peptiden an Mukus/Müzine 49 a) Durchflusszytometrie 49 b) Enzyme-linked lectin assay 50 c) Western Blol 51 3.B.7 Reversibilität der Bindung und Einfluss auf die funktionelle Aktivität der AMP 52 3.B.8 Fraktionierung der Extrakte mittels RP-HPLC 53 3.B.9 Weitere Charakterisierung der HPLC-Fraktionen 54 a) Durchflusszytometrie 54 b) Coomassie-Färbung von Proteingelen 54 c) Matrixassistierte Laserdesorption/Ionisations time-of-flight Massenspektrometrie 54 d) Dot Blot-Analysen 54 3.B.10 In v/n-0-dimerbildungvon HBD-I und HBD-2 55

4 3.B.11 Histologische Darstellung der Mukusschicht 55 a) Periodic-Acid-Schiff-Färbung 56 b) Alcianblau-Färbung 56 c) Mucicarmin-Färbung 57 3.B.12 Immunhistochemie 58 Teil C: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukosa des Dickdarms bei CEP 3.C.1 Probenmatcrial 60 3.C.2 Aufarbeitung der Proben 60 3.C.3 Weitere Analysen C.4 Quantifizierung des Cathelicidins LL-37 mittels Western Blot ERGEBNISSE 62 Teil A: Mukosa AI: Methodenetablierung A2: Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukosa des Dickdarms 4.A1.1 Aufarbeitung der Proben 63 4.A1.2 Bestimmung der Proteinkonzentration in Mukosa-und Mukusextrakten 63 4.A1.3 Auftrennung der Proteinextrakte mittels RP-HPLC 64 4.A1.4 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 65 4.A2.1 Auftrennung von Mukosa-Proteinextrakten mittels RP-HPLC 66 4.A2.2 Analyse der antimikrobiellen Aktivität von Mukosa-Proteinextrakten 67 4.A2.3 Identifizierung antimikrobiell wirksamer Peptide/Proteine in Mukosa-Proteinextrakten 68 a) Allgemeiner Überblick Uber die Peptid-/Proteinzusammenselzung 68 b) Dot Blot- und MALDl-TOF-MS-Analysen 69 Teil B: Mukus Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukusschicht des Dickdarms 4.B.1 Beta-Aktin Dot Blots 72 4.B.2 Antimikrobielle Aktivität der Mukusschicht des Rektums 73 4.B.2.1 Visualisierung der antimikrobiellen Aktivität mittels Fluoreszenzmikroskopie 73 4.B.2.2 Durchflusszytometrische Analyse der antimikrobiellen Aktivität 74 4.B.3 Bindung von kationischen AMP im Mukus an negativ geladene Müzine 74 4.B.3.1 Durchflusszytometrie 75 4.B.3.2 Enzyme-Iinked lectin assays 76 4.B.3.3 Western Blot 77 4.B.4 Reversibilität der Bindung und Einfluss auf die funktionelle Aktivität der AMP 78 4.B.S Detaillierte Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukusschicht B.5.1 Auftrennung von Mukus-Protcinextrakten mittels RP-HPLC 81 4.B.5.2 Antimikrobielle Aktivität von fraktionierten Mukusextrakten 81

5 4.B.5.3 Identifizierung antimikrobiell wirksamer Peptide/Proteine in Mukus-Proteinextraklen 83 a) Allgemeiner Überblick über die Peptid-/Proleinzusammenselzung 83 b) Dot Blot- und MALDI-TOF-MS-Analysen 84 4.B.6 Histologische Färbungen und Immunhistochemie 89 Teil C: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukosa des Dickdarms bei CED 4.C.1 Qualitative Analysen C.2 Quantitative Analysen DISKUSSION 93 Teil A: Mukosa AI: Methodenetablierung A2: Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukosa des Dickdarms 5.A1.1 Aufarbeitung der Proben 93 5.A1.2 Proteinbestimmung 94 5.A1.3 RP-HPLC und MALDI-TOF-MS 95 S.A2.1 Analyse der antimikrobiellen Aktivität von Mukosa-Proteinextrakten 96 S.A2.2 Identifizierung antimikrobiell wirksamer Peptide/Proteine in Mukosa-Proteinextrakten 96 a) Die antimikrobiellen Peptide HBD-1 und LL b) Weitere Peptide/Proteine mit antimikrobieller Wirksamkeit 98 Teil B: Mukus Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukusschicht des Dickdarms S.B.1 Die Mukusschicht des Dickdarms ist stark antimikrobiell wirksam B.2 Antimikrobielle Peptide binden im Mukus an negativ geladene Müzine 103 S.B.3 Die Bindung von AMP an Müzine scheint reversibel zu sein B.4 Identifizierung antimikrobiell aktiver Peptide/Proteine in Mukusextrakten 106 a) Die antimikrobiellen Peptide HBD-1 und LL b) Weitere Peptide/Proteine mit antimikrobieller Wirksamkeit 107 Teil C: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen Analyse der antimikrobiellen Eigenschaften der Mukosa des Dickdarms bei CED 5.C.1 Qualitative Analysen C.2 Quantitative Analysen 108 Teil D: Zusammenfassung der Ergebnisse und Ausblick 1 S.D.l Zusammenfassung '09 5.D.2 Ausblick 109

6 6. LITERATURVERZEICHNIS PUBLIKATIONSLISTE DANKSAGUNG LEBENSLAUF SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 132