Corynebacterium glutamicum

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Sabine Schulz
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1 Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zu AmtR, dem Stickstoffregulator in Corynebacterium glutamicum Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Kristin Hasselt aus Altdöbern TIB/UB Hannover

Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung

2 Inhalt 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung Corynebakterien Stickstoffaufnahme und -assimilation in C. glutamicum Stickstoffabhängige Regulation in C glutamicum DieTetR-Familie TetR QacR EthR AmtR Zielsetzung der Arbeit 15 3 Material und Methoden Bakterienstämme und Plasmide Nährmedien und Kultivierungsbedingungen Nährmedien für E. coli Nährmedien für C. glutamicum Antibiotika Kultivierungsbedingungen Biochemische Techniken Herstellung von Zellextrakten aus E. coli und C glutamicum Proteinreinigung Reinigung von AmtR Gewinnung des Fusionsproteins MBP-AmtR Gewinnung von reinem AmtR-Protein Herstellung von Selenomethionin-markiertem AmtR-Protein Reinigung von GlnK-AMP Dynabeads Protein G 26

2 Nährmedien und Kultivierungsbedingungen 20 3.2.1 Nährmedien für E. coli 20 3.2.2 Nährmedien für C. glutamicum 20 3.2.3 Antibiotika 21 3.2.4 Kultivierungsbedingungen 22 3.

3 Strepll-7og Bestimmung der Proteinkonzentration mittels NanoDrop 1000 Spectrometer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Färbung mit Coomassie Brilliant Blue Western blot Kristallisation Kristallisation von nativem und Selenomethionin-markiertem AmtR-Protein Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit DNA Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit GlnK-Peptid Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit AMP Datensammlung und Strukturlösung Oberflächenplasmonresonanzmessungen Molekularbiologische Techniken DNA-Techniken Plasmid-Präparationen aus E. coli Präparation chromosomaler DNA aus C. glutamicum Reinigung und Konzentrierung von DNA Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA Modifizierung von Nukleinsäuren Ligation von DNA Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Ortsgerichtete Mutagenese Sequenzierung von DNA Southern blot Gelretardationstests RNA-Techniken Präparation von Gesamt-RNA und RNA-Gelelektrophorese RNA-Hybridisierung (Dot blot) 48

3.7.4 Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit AMP 33 3.3.7.5 Datensammlung und Strukturlösung 33 3.3.8 Oberflächenplasmonresonanzmessungen 33 3.4 Molekularbiologische Techniken 35 3.4.1 DNA-Techniken 35 3.

4 3.5 Techniken zur Manipulation von Zellen Herstellung und Transformation chemisch kompetenter E. co//-zellen Präparation und Elektroporation elektrokompetenter C. glutamicum-iewen Herstellung von Deletionsmutanten in C. glutamicum Arbeiten mit C. glutamicum-zewen in Kultur Fluoreszenzspektrometrie 54 4 Ergebnisse Analyse von AmtR-Varianten AmtR-Varianten in der DNA- und der GlnK-Bindestelle Herstellung einer omtr-deletionsmutante Gelretardationsexperimente Oberflächenplasmonresonanzexperimente (SPR-Experimente) Abschätzung der Bindekonstanten der AmtR- und AmtR-Varianten-Interaktion mit DNA anhand von Gelretardationsexperimenten AmtR-DNA-Bindung Variation der AmtR-Bindesequenz stromaufwärts des amtfl-gens Gelretardationsexperimente Fluoreszenzmessungen Chromosomale Integration des variierten amtfl-promotors RNA-Hybridisierungsexperimente zur Untersuchung von KH Vergleich der Promotorstärke von gltb in den Stämmen C. glutamicum Wildtyp und KH Wuchsverhalten der C. glutamicum-stämme Wildtyp, KH1 und KH Oberflächenplasmonresonanzexperimente mit amtb- und g/n/l-promotorregionen Reinigung und Strukturaufklärung von AmtR AmtR-Reinigung Kristallisation und Strukturaufklärung von AmtR Reinigung von GlnK-AMP Intein-Tog 85

1 Analyse von AmtR-Varianten 55 4.1.1 AmtR-Varianten in der DNA- und der GlnK-Bindestelle 55 4.1.2 Herstellung einer omtr-deletionsmutante 57 4.1.3 Gelretardationsexperimente 59 4.1.4 Oberflächenplasmonresonanzexperimente (SPR-Experimente) 61 4.

5 4.4.2 Strepll-Tog Magnetic beads 88 5 Diskussion Das regulatorische Netzwerk in C. glutamicum AmtR-DNA-Interaktion Variation von AmtR Variation der DNA AmtR-Autoregulation AmtR-GlnK-Interaktion AmtR-Struktur 99 6 Anhang Konstruktion von Plasmiden Herstellung von Sonden und DNA-Fragmenten RNA-Sonden Southern blotsonde zum Nachweis der Deletion von amtr DNA-Fragmente für Gelretardationsexperimente (EMSAs) DNA-Fragmente für Oberflächenplasmonresonanzexperimente (SPR) Konstruktion von Stämmen 110 Literaturverzeichnis 112 Publikationen 125 Abkürzungsverzeichnis 126

2 Herstellung von Sonden und DNA-Fragmenten 106 6.2.1 RNA-Sonden 106 6.2.2 Southern blotsonde zum Nachweis der Deletion von amtr 106 6.2.3 DNA-Fragmente für Gelretardationsexperimente (EMSAs) 106 6.

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