Identifikation einer neuen WRKY-Transkriptionsfaktorbindungsstelle. in bioinformatisch identifizierten,

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1 Identifikation einer neuen WRKY-Transkriptionsfaktorbindungsstelle in bioinformatisch identifizierten, Pathogen-responsiven c/s-elementen aus Arabidopsis thaliana Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Fabian Machens Hildesheim

2 Inhalts Verzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis ^ 2. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VIII 3. Einleitung Pflanzen sind einer Vielzahl von Pathogenen ausgesetzt Das pflanzliche Immunsystem Transkriptionelle Netzwerke in der Pathogenantwort Bioinformatische und experimentelle Analysen können zur Identifizierung neuer c/s-elemente führen Ein neues c/s-element in Motivgruppe 27? Ziele dieser Arbeit Material und Methoden Chemikalien & Enzyme Lösungen Agarose-Gelelektrophorese Antibiotika- und Herbizid-Lösungen Isolation und Transfektion von Petersilie-Protoplasten Isolation und Transfektion von Arabidopsis-Protop\as\en Sterilisation und Aussaat von Arabidopsis-Sam&n Transformation von A. thaliana Transformation von Hefe-Zellen Plasmidpräparation aus Hefe-Zellen Plasmid-Mini-Präparation aus. coli Proteinbestimmung nach Bradford Aufreinigung His-getaggter Proteine SDS-PAGE Western Blot Gelshift-Assays Luciferase-Assays ß-Glucuronidase-Assays Nährmedien Arabidopsis-Pflanzen Bakterien 27!

3 II Botrytis cinerea Petersilie-Zellkultur Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana 4.5. Petersilie-Zellkultur 4.6. Bakterien-, Hefe- und Pilz-Stämme Oligonukleotide und Peptide Plasmide Verbrauchsmaterialien Geräte Methoden Manipulation und Erstellung von DNA-Konstrukten Annealing einzelsträngiger Oligonukleotide Polymerasekettenreaktion (PCR) RNA-Isolation aus A. thaliana Reverse T ranskription Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA-Lösungen Agarose-Gelelektrophorese von DNA und RNA Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Herstellung und Transformation elektrokompetenter E. coli- und A. tumefaciens-zellen Herstellung und Transformation chemisch kompetenter E. coli-zellen Plasmidpräparation aus E. coli Erstellung von Dauerkulturen Sequenzierung von DNA-Molekülen Allgemeine Sequenzanalysen, Alignments etc Erstellung von T-DNA-Konstrukten zur Herstellung von Reportergenpflanzen Erstellung von Reportergenkonstrukten für die Protoplasten-Transfektion Erstellung von Reportergenkonstrukten für Yeast One-Hybrid-Screenings Klonierung von Transkriptionsfaktoren Konstrukte zur rekombinanten Proteinexpression T-DNA-Konstrukte zur Überexpression von Transkriptionsfaktoren Expression & Aufreinigung rekombinanter Proteine in E. coli Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Dialyse Western Blot 49 w Coomassie-Färbung von Proteingelen 50

4 Erstellung Biotin-markierter DNA-Moleküle Gelshift-Assay Transformation von Hefe-Zellen Plasmidpräparation aus Hefe-Zellen Yeast One-Hybrid-Screening Kultivierung der Petersilie-Zellkultur Isolation und Transfektion von Petersilie-Protoplasten Kultivierung von A thaliana in Steril- bzw. Erdkultur Isolation und Transfektion von Arabidopsis-Protop\as\en Transformation und Selektion von A. thaliana Pathogeninfektion von A. thaliana Proteinbestimmung nach Bradford Luciferase-Assays Qualitative GUS-Färbungen Quantitative GUS-Assays Analyse von Promotorsequenzen mittels POBO Ergebnisse Die Pep25-responsive Region in 30I-8_M1S1 bzw. 27D-10_M1S2 enthält die Kernsequenz der Motivgruppe I-8_M1S1 und 27D-10_M1S2 vermitteln eine leichte Reportergenaktivität in nicht Pathogen-infizierten Arabidopsis-Pflanzen I-8_M1S1- und 27D-10_M1S2-Pflanzen zeigen bei B. cinerea-infektion eine leichte Pathogen-Responsivität WRYK70, SPL7 und JAG sind potentielle Regulatoren der untersuchten Sequenzen Untersuchungen zur Transaktivierbarkeit von 30I-8_M1S1 und 27D-10_M1S2 durch ihre potentiellen Regulatoren Die potentielle SPL7-TFBS in der 30I-8_M1S1-Sequenz ist klonierungsbedingt Mutationsanalysen zur Identifikation potentieller WRKY70-TFBS in 30I-8_M1S1 und 27D-10_M1S Expression rekombinanter Transkriptionsfaktoren in E. coli SPL7 interagiert direkt mit 30I-8_M1 S WRKY70 bindet die für die Transaktivierung notwendige Sequenz CGACTTTT direkt WRKY70 interagiert auch mit weiteren Sequenzen aus Motivgruppe

5 5.12. Die WRKY70-TFBS liegt innerhalb der Pep25-responsiven Region von 30I-8-M1S Die postulierte WRKY70-TFBS ist in möglichen Zielgenen angereichert Diskussion Die Interaktion von 30I-8_M1S1 und SPL7 hat keine Relevanz für die Pep25-Responsivität WRKY70, ein zentraler Regulator der Pathogenantwort, bindet die Sequenz CGACTTTT in 30I-8_M1S Kann ein WRKY-TF aus Petersilie identifiziert werden, der die Pep25-Responsivität von 30I-8_M1S1 vermittelt? Sind weitere Faktoren in die Pep25-Responsivität von 30I-8_M1S1 involviert? Lässt sich die beobachtete Pathogen-Responsivität in transgenen 30I-8_M1S1-Linien mit der Expression von WRKY70 korrelieren? Mögliche Ursachen für die ungewöhnliche Bindungsspezifität von WRKY Anhand von Bindungsstudien kann eine Konsensussequenz für die WRKY70-TFBS postuliert werden Welche Bedeutung hat die WRKY70-TFBS in vivo? Sind die potentiellen WRKY70-Zielgene Pathogen-responsiv? Wie kann die Transaktivierung von 27D-10_M1S2 durch WRKY70 erklärt werden? Zusammenfassende Bewertung der Ergebnisse und Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Materiallisten Glycerinkulturen und DNA-Konstrukte Primer und Oligonukleotide Pflanzensamen Danksagung 235