Inhalt. 1 Einleitung 1. 2 Problemstellung 34 3 Material und Methoden 35

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Rainer Bretz
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1 I I Abkürzungen VI Tabellen XI Abbildungen XII 1 Einleitung Guaninnukleotid-bindende Proteine in der Signaltransduktion Die G-Proteine der Ras-Superfamilie Regulationsmechanismen Strukturelle Gemeinsamkeiten kleiner regulatorischer G-Proteine Posttranslationale Modifikationen Gliederung der Ras-Superfamilie Rho-Proteine der Rop-Unterfamilie Charakteristika der Rop-Aminosäuresequenzen Posttranslationale Modifikationen und Lokalisation der Rop-Proteine Klassifizierung der Rop-Proteine Differenzielle Expression der Rop-Gene in pflanzlichen Geweben Rop-kontrollierte Signalwege Die Rolle von Rop in der Pathogenabwehr Die Kontrolle der H 2 O 2 -Produktion durch Rop Rop-kontrollierte Faktoren zur Steuerung der Abwehrreaktionen Rop kontrolliert diverse Prozesse in der Entwicklung der Pflanze Die Rolle von Rop in der Regulation der Meristemerhaltung Die Funktion von Rop in der Sekundärwandbildung Die Funktion von Rop in Phytohormon-Signalwegen Die Rolle von Rop im Auxin-Signalweg Die Rolle von Rop im Abszisinsäure-Signalweg Die Kontrolle stressbedingter Reaktionen der Pflanze durch Rop Die Rolle von Rop in Aktinpolymerisierungsprozessen Regulation des Aktinzytoskeletts durch tierische Rho-Effektoren Die Rolle von Rop in der Regulation des Spitzenwachstums von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren Die Funktion von Rop in diffus wachsenden Zellen Rop-kontrollierte Faktoren zur Regulation von Aktinstrukturen Regulation der Aktivität von Rop Regulation durch Guaninnukleotid-Austauschfaktoren Regulation durch GTPase-aktivierende Proteine Regulation durch Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitoren Potentielle Rop-Effektoren genannt RICs 32 2 Problemstellung 34 3 Material und Methoden Material Geräte Kit-Systeme 36

2 II Verbrauchsmaterialien Chemikalien und Biochemikalien Chemikalien Säulenmaterialien Nukleotide Protease-Inhibitoren Antibiotika Enzyme Antikörper und Konjugate Protein- und Nukleinsäure-Grössenstandards Standardpuffer Nährmedien Medien zur Anzucht von Escherichia coli Medien zur Anzucht von Hefe Medien zur Anzucht von Insektenzellen Medien zur Anzucht von Säugerzellen Vektoren Oligonukleotide Plasmide Bakterielle Expressionsplasmide Expressionsplasmide für Säugerzellen Expressionsplasmide für Insektenzellen Expressionsplasmide für Pflanzen Hefe-Zweihybridplasmide cdna-bibliotheken Stämme Escherichia coli-stämme Saccharomyces cerevisiae-stämme Zelllinien Pflanzenmaterial Computer-Software Methoden Kulturmethoden Bakterien Kulturbedingungen und Lagerung Herstellung kompetenter Bakterien Transformation von E. coli Proteinexpression in E. coli Aufschluss von Bakterien Amplifizierung der cdna-bank Hefe Kulturbedingungen Transformation der Hefe L Analyse von Hefe-Zweihybrid-Interaktionen auf Selektionsplatten Semiquantitative Analyse von Hefe-Zweihybrid-Interaktionen mit der Galaktosidase-Reportergenanalyse Insektenzellen Kulturbedingungen Stabile Transfektion mit dem InsectSelect-System Transfizieren von Sf21-Zellen mit rekombinanter Bakmid-DNA Bestimmung des Virus-Titers 53

3 III Virusamplifikation Vereinzelung von Viren Proteinexpression in Sf21-Zellen Säugerzellen Kulturbedingungen Transiente Transfektion durch Lipofektion Transiente Transfektion nach der DEAE-Dextran-Methode Zwiebel Epidermiszellen Transformation Molekularbiologische Methoden Minipräparation von Plasmid-DNA Midipräparation von Plasmid-DNA Maxipräparation von Plasmid-DNA Isolierung der Plasmid-DNA der cdna-bibliothek Präparation von Bakmid-DNA Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Polymerasekettenreaktion (PCR) Ortsspezifische Mutagenese Sequenzierung von DNA Restriktion von DNA Dephophorylierung von DNA Ligation von DNA-Fragmenten Aufreinigung von DNA-Fragmenten Agarosegel-Elektrophorese Gelelution von DNA-Fragmenten Biochemische Methoden Proteinbestimmung nach Bradford SDS-PAGE Färbung von SDS-Gelen und PVDF-Membranen mit Coomassie Brilliant Blue Silberfärbung von SDS-Gelen Western Blot Immunologischer Nachweis von Proteinen im Western Blot (Immunoblot) Immunzytochemischer Nachweis von Proteinen Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie Reinigung von His 6 -Rop Reinigung von GST-RopGAP2 aus E. coli Reinigung von RopGAP2 aus Sf21-Zellen Reinigung von GST-RIC6 und GST-RIC Proteolytischer Verdau im Gel und MALDI-Analyse Nukleotidaustausch an Rop Nukleotidbefreiung von Rop Messung der intrinsischen GTP-Hydrolyse durch Rop Michaelis-Menten-Kinetik pull down aus Cos7-Zelllysaten In vitro pull down-interaktionstest Fluoreszenzspektroskopische Methoden Bestimmung der Nukleotiddissoziationsrate Bestimmung der Aktivierungsenergie der Nukleotiddissoziation Magnesiumabhängigkeit der Nukleotiddissoziation 72

4 IV Fluoreszenzpolarisationstitration Fluoreszenztitration stopped flow-messung Konfokale Mikrokopie 74 4 Ergebnisse Biochemische und funktionelle Charakterisierung der Rop- Proteine aus Arabidopsis thaliana Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften des G-Proteins Rop Reinigung von Rop4 aus Escherichia coli Biochemische Charakterisierung von Rop Nukleotiddissoziation von Rop Temperaturabhängigkeit der Nukleotiddissoziation von Rop Abhängigkeit der Nukleotiddissoziation von MgCl Nukleotidaffinitäten von Rop Die Hydrolyseaktivität von Rop Funktion von Rop4 in der Regulation der Aktinorganisation Lokalisation von Rop4 und Aktin in Zwiebel-Epidermiszellen Der Einfluss von Rop4 auf das Aktinzytoskelett von Säugerzellen im Vergleich zu RhoA, Rac1 und Cdc Expression von Rop4 in Säugerzellen Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in NIH3T3-Zellen Expression von RhoA, Rac1 und Cdc42 in HeLa-Zellen In vitro-interaktion von Rop4 mit der G-Protein-bindenden Domäne von humaner p21-aktivierter Kinase Aktivierung von Rop4 durch den Rac-spezifischen Austauschfaktor Tiam Regulation von Rop4 durch RopGAP2 aus Arabidopsis thaliana Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften von RopGAP Reinigung von RopGAP Expression in E. coli und Reinigung eines RopGAP2-Fragmentes Expression und Reinigung von RopGAP2 mit Hilfe des Bakulovirus- Systems in Spodoptera frugiperda-zellen Regulation von Rop-Proteinen durch RopGAP Untersuchung der Interaktion von RopGAP2 mit Rho-Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem Untersuchung der Interaktionen von RopGAP2 mit unterschiedlichen Rops im Hefe-Zweihybridsystem Untersuchung der Interaktion von RopGAP2 mit Rop4 in vitro Aktivierung der Hydrolyse von Rop4*GTP durch RopGAP Interaktion von Rops mit RICs Bioinformatische Analyse sequenzdeterminierter Eigenschaften der RICs aus A. thaliana Die Interaktion zwischen Rops und RICs Untersuchung der Interaktion von RICs mit menschlichen Rho- Proteinen im Hefe-Zweihybridsystem Untersuchung der Spezifität der Rop-RIC-Interaktion im Hefe- Zweihybridsystem 110

5 V Untersuchung der Interaktion von RICs mit Rop4 in vitro Funktion von RICs in der Regulation der Aktinorganisation Diskussion Rop4 hat die Charakteristika eines molekularen Schalters Rop4 ist ein aktives Guaninnukleotid-bindendes Protein Rop4 bindet Guaninnukleotide mit hoher Affinität Die Nukleotidbindung durch Rop4 erfolgt magnesiumabhängig Die intrinsische Hydrolyse von GTP durch Rop4 ist relativ langsam Der menschliche Austauschfaktor Tiam1 beschleunigt den Nukleotidaustausch an Rop RopGAP2 steigert die Hydrolyseaktivität von Rop RopGAP2 ist ein aktiver Regulator von Rop RopGAP2 hat zwei unterschiedliche GNBP-Bindestellen CRIB- und GAP-Domänen binden an dieselben Regionen des GNBPs Die CRIB-Domäne ist für die Aktivität von RopGAP erforderlich Die Bindung von RopGAP an Rop erfolgt nukleotidabhängig Die CRIB-Domäne vermittelt die Rop-Spezifität von RopGAP RICs sind spezifische Interaktionspartner von Rops Alternatives Spleißen der RIC-Gene? Rop4 interagiert mit RIC6 und RIC Die Interaktion von Rops mit RICs erfolgt teilweise hochspezifisch Das Auftreten spezifischer RIC-Rop-Interaktionen korreliert mit der Gruppenaufteilung der RICs Die Rolle von Rop4 als Regulator des Aktinzytoskelettes Rop4 induziert Morphologieänderungen in Säugerzellen Rop4 übernimmt die Funktionen von Rac1 in Säugerzellen Rop4 ist in Zwiebel-Epidermiszellen membranlokalisiert Die Rolle von RICs in der Regulation der Aktindynamik Ausblick Zusammenfassung 140 Summary Literatur 144 Danksagung Lebenslauf Erklärung XIV XV XVI

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