Multifunktionale DNA Kassetten zur konditionalen Mutagenese in der Maus

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1 Multifunktionale DNA Kassetten zur konditionalen Mutagenese in der Maus Von der Fakultat fur Lebenswissenschaften der Technischen Universitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Karina Maria Nawrath aus GroG-Strehlitz

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Zielsetzung Allgemeine Einleitung Transgene Mause Konventionelles gene targeting Konditionales gene targeting Sequenzspezifische Rekombinationssysteme Konditionale gene targeting Strategien Systeme zur Expression sequenzspezifischer Rekombinasen Induzierbare Rekombinase Systeme Transkriptionelle Kontrolle der Rekombinase Aktivitat Posttranslationelle Kontrolle der Rekombinase Aktivitat Fusionen von Rekombinasen mit Liganden bindenden Domanen Fusionen von Rekombinasen mit Liganden bindenden Domanen von Ostrogenrezeptoren Fusionen von Rekombinasen mit Liganden bindenden Domanen von Progesteronrezeptoren Gene trapping Konventionelle trapping Vektoren Konditionale gene trapping Vektoren Nonsense mediated mrna decay (NMD) Aufgabenstellung Ergebnisse Bifunktionale Cre Expressionskonstrukte Bifunktionale Cre Expressionskonstrukte mit multiplen Liganden bindenden Domanen Bifunktionale Cre Expressionskonstrukte mit multiplen ERT2 Domanen Bifunktionales Cre Expressionskonstrukt mit ERT2 und PR Domanen Bifunktionales Cre Expressionskonstrukt mit einer ERT2 Domane (konstitutiv aktiv zu regulierbar) Untersuchung der Funktionalitat der Rekombinase Zielsequenzen Funktionsanalysen der induzierbaren und konstitutiv aktiven Cre Fusionsrekombinasen Bestimmung der Cre Aktivitat mittels lacz Farbung Bestimmung der Cre Aktivitat mit Hilfe des Dual-Light Systems Generierung eines BAC Transgens mittels ET Rekombination Co-Expression von Genen mittels 2A "CHYSEL" Technologie 53

3 2.3 Induzierbare NMD Kassetten zur konditionalen Mutagenese Strategie zur Herstellung einer induzierbaren NMD Kassette System zur Untersuchung der Funktion von induzierbaren NMD Kassetten p 7 -lntegrin Gen basierende induzierbare NMD Kassette Funktionsanalysen der p 7 -lntegrin Gen basierenden induzierbaren NMD Kassetten Retinoblastom Gen basierende induzierbare NMD Kassetten Funktionsanalysen der Retinoblastom Gen basierenden induzierbaren NMD Kassetten Funktionsanalysen der modifizierten Retinoblastom Exon 23 basierenden induzierbaren NMD Kassetten Kombinierte induzierbare NMD polya Kassetten Funktionsanalysen der kombinierten induzierbaren NMD polya Kassetten Untersuchung der Funktionalitat der Rekombinase Zielsequenzen Untersuchung der Funktionalitat von induzierbaren NMD Kassetten mittels stabiler Transfektion Diskussion und Ausblick Bifunktionale Cre Expressionskonstrukte Die Rekombinase Zielsequenzen sind funktionell Cre vermittelte Aktivitat der bifunktionalen Expressionskonstrukte kann mittels Dual-Light System bestimmt werden Konstrukte mit multiplen LBDs zeigen ein schlechtes Signal-zu-Rausch Verhaltnis Induzierbare Konstrukte mit einer ERT2 LBD zeigen ein gutes Signal-zu-Rausch Verhaltnis Schlussfolgerung Die Herstellung eines BAC Transgens mittels ET Rekombination Ausblick Co-Expression von Genen mittels 2A "CHYSEL" Technologie Induzierbare NMD Kassetten zur konditionalen Mutagenese Die durch NMD Kassetten induzierte Inaktivierung der Luciferase Aktivitat kann mittels Dual-Luciferase Reporter Assay System bestimmt werden NMD Kassetten zeigen Unterschiede in der Wirkung der NMD vermittelnden Exons auf die Luciferase Aktivitat Rekombinase Erkennungssequenzen beeinflussen die NMD vermittelnde Wirkung der NMD Kassetten Kombinierte induzierbare NMD polya Kassetten zeigen keine verbesserte NMD vermittelnde Wirkung Nur Iox66/71 aber nicht FRT LE/RE Rekombinase Zielsequenzen sind for Inversionsstrategien geeignet Schlussfolgerung Emetine fuhrt zum Zelltod von ES-Zellen NMD Kassetten als Bestandteil von gene targeting Kassetten NMD Kassetten als Bestandteil von gene trapping Kassetten Ausblick Zusammenfassung 103

4 5. Material und Methoden Chemikalien allgemein Materialien fur die Zellkultur Zellinien Verwendete Medien, Losungen und Puffer in der Zellkultur Methoden in der Zellkultur Einfrieren und Auftauen von Zellen Splitten und Expandieren von Zellen Zellzahlbestimmung Transiente Transfektion von Nierenzellen Stabile Transfektion von ES-Zellen Isolierung von ES-Zellklonen Einfrieren von 96-Loch Platten mit ES-Zellklonen Zelllyse und anschliegende DNA Aufarbeitung aus ES-Zellklonen Hemmung der Protein Biosynthese mittels Emetine lacz Farbung Losungen Reporter Assays zur Bestimmung von Reportergen Aktivitaten Dual-Light System Dual-Luciferase Reporter Assay System Molekularbiologische Standardmethoden Verwendete Puffer Isolierung von DNA Restriktionsverdaus Agarosegelelektrophorese Polymerase Kettenreaktion (PCR) Herstellung eines Polylinkers Aufreinigung von DNA aus einem Agarosegel Klassische Klonierung von DNA Fragmenten, PCR Produkten sowie ETKIonierung Isolierung von DNA Sonden Southern Blot und Hybridisierung Radioaktive Markierung von DNA-Sonden Bakterien Medien fur Bakterien Escherichia coli Zelllinien Transformation von Bakterien Verwendete Antibiotika Losungen Verwendete BACs, genomische DNA und Plasmide Literaturverzeichnis 120

5 7. Anhang Primer fur bifunktionale Cre Expressionskonstrukte Sequenzierungsprimer Primer fur ET Rekombination Primer fur bicistronische Expressionsvektoren Oligonukleotide fur die Herstellung des Polylinkers Primer fiir induzierbare NMD Kassetten Sequenz des Fragments, das Erkennungssequenzen zur Rekombinase vermittelten Inversion der NMD Kassetten enthalt Sequenz der kombinierten induzierbaren NMD Kassetten NMD polya NMD polya Abkiirzungsverzeichnis 134