Charakterisierung von CD25+ regulatorischen T Zellen
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- Alwin Gerhardt
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1 Charakterisierung von CD25+ regulatorischen T Zellen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) eingereicht im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Markus Kleinewietfeld aus Rietberg Berlin 2006
2 1. Gutachter: Prof. Thomas Blankenstein 2. Gutachter: Prof. Wolfgang Uckert Disputation am
3 für meine Eltern
4 Charakterisierung von CD25+ regulatorischen T-Zellen 1. EINLEITUNG IMMUNOLOGISCHE SELBST-TOLERANZ Zentrale Toleranz Periphere Toleranz REGULATORISCHE T-ZELLEN ZUR AUFRECHTERHALTUNG PERIPHERER TOLERANZ Tr1 und Th3 CD4+ regulatorische T-Zellen Natürliche CD25+CD4+ regulatorische T-Zellen Phänotyp von CD25+ regulatorischen T-Zellen Entstehung von CD25+ regulatorischen T-Zellen Wirkungsweise von CD25+ regulatorischen T-Zellen Kontrolle von CD25+ regulatorischen T-Zellen Unterschiede von humanen und murinen CD25+ regulatorischen T-Zellen DIE ROLLE VON CD25+ REGULATORISCHEN T-ZELLEN IN AUTOIMMUNKRANKHEITEN UND IN DER TUMORIMMUNOLOGIE CD25+ Treg zur Therapie von Autoimmunkrankheiten Die Rolle von CD25+ Treg bei der Tumorimmuntherapie ZIELSETZUNG DER ARBEIT MATERIAL UND METHODEN MATERIALIEN Chemikalien & Verbrauchsmaterial Peptide und biologisches Material Puffer, Medien und Lösungen Versuchstiere Monoklonale Antikörper Synthetische Oligonukleotide Geräte Software METHODEN Agarose Gelelektrophorese Präparation von Zellsuspensionen Präparation von murinen Milzzellen Präparation von murinen Thymuszellen Präparation von murinen Lymphknotenzellen Präparation von murinen PBMC Präparation von murinen Zellen aus Peyerschen Plaques Präparation von Tumor-Infiltraten Präparation von ZNS-Infiltraten Präparation von humanen PBMC Antikörperfärbung Oberflächen Färbung 36 1
5 Charakterisierung von CD25+ regulatorischen T-Zellen Intrazelluläre Färbung Fluoreszenz-aktivierte-Zellsortierung/Durchflusszytometrie Allgemeines Prinzip Sortierung von Zellen Durchflusszytometrische Analyse von Zellsuspensionen Magnetische Zellsortierung RNA Isolation Copy DNA (cdna) Präparation Realtime RT-PCR Genexpressionsanalysen Zellkultur Suppressions-Assay Migrations-Assay Proliferations-Assay & T-Zell Restimulation Ko-Kultivierung von Treg und dendritischen Zellen BrdU Markierung und durchflusszytometrischer Nachweis CFDA-SE Markierung und adoptiver Transfer von T-Zellen Induktion und Wertung von EAE in SJL/J Mäusen Adhäsions-Assay Tumorinduktion mit J558L Plasmazytom Zellen J558L-Tumorzelllinie Applikation von Tumorzellen Tumorinduktion mit B16 Melanom Zellen B16-Tumorzelllinie Applikation von Tumorzellen ERGEBNISSE GENEXPRESSIONSANALYSE VON CD25+ CD4+ T-ZELLEN CCR6 DEFINIERT EFFEKTOR-GEDÄCHTNISZELL ÄHNLICHE REGULATORISCHE CD25+ CD4+ T-ZELLEN IN DER MAUS (T REM ) Die CCR6 Expression auf CD4+T-Zellen in der Maus CCR6 als Treg Marker Die CCR6 Expression segregiert mit einem aktivierten Effektor-Gedächtniszell Phänotyp Die CCR6 Expression definiert T-Zellen mit einer hohen Proliferationsrate Eine CCR6 Expression wird nach Antigenkontakt in vivo induziert CCR6+ Treg können auf das Chemokin CCL20 reagieren CCR6+ Treg unterscheiden sich funktionell von CCR6- Treg CCR6+ Treg akkumulieren in peripheren Geweben im Verlauf von Entzündungen CCR6+ Treg akkumulieren im zentralen Nervensystem während des Verlaufs von EAE CCR6+ Treg akkumulieren im Tumor-Infiltrat CCR6+ EFFEKTOR-GEDÄCHTNISZELL ÄHNLICHE REGULATORISCHE CD25+ T ZELLEN IM MENSCHEN CCR6 Expression auf CD4+T-Zellen im Menschen CCR6+ humane CD25 high CD4+ Zellen sind regulatorische T-Zellen 97 2
6 Charakterisierung von CD25+ regulatorischen T-Zellen CCR6+ regulatorische- und Effektor-Gedächtniszell ähnliche Populationen im Menschen unterscheiden sich durch eine differentielle Adhäsionsmolekül-Expression Abwesenheit von CD49d auf CCR6+ CD25 high Effektor-Gedächtniszell ähnlichen Treg Die Regulation von CD49d steuert die differentielle Expression von VLA-4 auf T REM und T EM Gegensätzliche Expression von VLA-4 und CLA auf humanen CD4+ T-Zellen CD49d und CCR6 definieren humane Treg mit der höchsten Foxp3 Expression CD49d und CCR6 Expression in der Maus DER EINFLUSS VON DEM CHEMOKINREZEPTOR CCR6 WÄHREND DER THYMUS GESTEUERTEN ENTWICKLUNG VON CD25+ TREG CCR6 Expression auf murinen Thymozyten CCR6+ CD25+ Thymozyten sind Treg-Vorläuferzellen Phänotyp von CCR6+ CD25+ Thymozyten CCR6 defiziente Mäuse haben keine offensichtlichen Störungen während der Treg Zell Entwicklung DISKUSSION EXPRESSIONSPROFIL VON CD25+CD4+ REGULATORISCHEN T-ZELLEN CCR6 DEFINIERT EFFEKTOR-GEDÄCHTNISZELL ÄHNLICHE REGULATORISCHE CD25+ CD4+ T-ZELLEN IN DER MAUS UND IM MENSCHEN (T REM ) CD25+ Treg bezeichnen eine heterogene Zellpopulation und können phänotypisch und funktionell in unterschiedliche Subpopulationen unterteilt werden Die Entstehung von T REM verläuft parallel zur T EM Induktion Die Balance von antagonistisch wirkenden CCR6+ T REM und T EM kontrolliert die Immunreaktion im entzündeten Gewebe DIE ENTWICKLUNG VON CD25+ TREG VORLÄUFERZELLEN IM THYMUS CCR6 Expression von Thymozyten CCR6 identifiziert Thymozyten mit der höchsten Foxp3 Expression Die CCR6 Expression im Thymus scheint eine Vorstufe von reifen CD25+ Thymozyten zu charakterisieren ZUSAMMENFASSUNG DER DISKUSSION AUSBLICK LITERATURVERZEICHNIS ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY ABKÜRZUNGEN DANKSAGUNG EIDESTATTLICHE ERKLÄRUNG 166 3
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