Synthese und Analytik von TmHU, dem Histon-ähnlichen Protein aus Thermotoga maritima, und dessen Einsatz als proteinogenes Gentransfersystem

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1 Synthese und Analytik von TmHU, dem Histon-ähnlichen Protein aus Thermotoga maritima, und dessen Einsatz als proteinogenes Gentransfersystem Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Frau Dipl.-Biochem. Claudia Immisch geb. am in Cottbus (Brandenburg) 1. Gutachter: Professor Dr. Rainer Rudolph Institut für Biotechnologie Martin-Luther-Universität Halle Wittenberg 2. Gutachter: Prof. Dr. Ralf Wagner Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Universitätsklinik Regensburg Verteidigt am: urn:nbn:de:gbv: [

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3 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG Gentherapie Barrieren des Gentransfers Nukleinsäuren für den Gentransfer Plasmid-DNA Minicircle-DNA Oligonukleotide Peptidnukleinsäuren Ribozyme DNAzyme Small interfering RNA und microrna Vektoren und Transfersysteme in der Gentherapie Virale Transfersysteme Adenoviren Retroviren Adeno-assoziierte Viren (AAV) Herpes-Simplex-Virus (HSV) Pocken- und Alphaviren Nicht-virale Gentransfers Transfer Vektor-freier Nukleinsäuren Transfer von Nukleinsäuren mittels physikalischer Methoden Lipofektion Polyfektion Gentransfer basierend auf implantierbaren Polymeren Die Familie der HU-Proteine Das histonähnliche Protein aus Thermotoga maritima, TmHU Zielstellung der Arbeit 27 2 MATERIAL UND METHODEN Material Chemikalien und Reagenzien Zusammensetzung häufig verwendeter Puffer Zelllinien und Medien für eukaryontische Zellkulturen Bakterienstämme und Medien für bakterielle Kulturen Verwendete Vektoren, Oligonukleotide und sirna Vektoren Oligonukleotide sirna Verwendete Antikörper 34

4 II Inhaltsverzeichnis Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe Molekularbiologische Methoden Herstellung chemisch kompetenter Zellen Reinigung von Plasmid-DNA Agarosegelelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Restriktion von Plasmid-DNA Ligation von DNA-Fragmenten in Vektoren Transformation von Plasmiden in chemisch kompetente Zellen Synthese von DNA-Fragmenten mittels Zwei-Schritt-PCR RNA-Synthese Alu-siRNA-Synthese sirna-synthese Fluoreszenzmarkierung von RNA Reinigung von RNA Reinigung mittels Phenol-Chloroform-Extraktion Reinigung mit Biospin-Säulen Proteintechnologische Methoden Expression, Reinigung und Analytik von TmHU Bakterienanzucht zur Expression von TmHU im 1-Liter- Maßstab Fermentation zur Synthese von TmHU Gewinnung des Zellrohextraktes im 1-Liter-Maßstab Gewinnung des Zellrohextraktes nach Fermentation Hitzepräzipitation der Wirtsproteine Proteinreinigung mittels Kationenaustauschchromatographie Umpufferung von TmHU mittels Tangentialflussfiltration Abreinigung der Endotoxine von TmHU Lyophilisation der Proben Aminosäure-Analytik Reversed Phase-High Performance Liquid-Chromatographie (RP-HPLC) Größenausschlusschromatographie Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Färbung eines SDS-Polyacrylamidgels mit Coomassie Brilliant Blue Western-Blot Fluoreszenzmarkierung von TmHU Fluoreszenzmarkierung durch Kopplung an Cystein Fluoreszenzmarkierung durch Kopplung an primäre Amine Kopplung des endosomolytischen Peptids E5 an TmHU-91Cys Zellbiologische Methoden Kultivierung und Passagieren eukaryontischer Zellen Kryokonservierung eukaryontischer Zellen 49

5 Inhaltsverzeichnis III Kontrolle der Zellkultur auf Mykoplasmenkontamination Transfektion mit kationischen Lipiden Transfektion mit TmHU Transfektion mit TmHU und Chloroquin Transfektion mit Calcium Zellaufschluss mit RIPA-Puffer Analyse von Zellen mittels Durchflusszytometrie Analyse der EGFP-Expression eukaryontischer Zellen Analyse der Aufnahme von TmHU oder RNA Analyse der vitalen und toten Zellen Färbung der Zellkerne Fixieren von Zellen Immunfluoreszenzfärbung von Zellen Fluoreszenzmikroskopie von Zellen Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (KLSM) Analyse der Fluoreszenzintensität EGFP-exprimierender Zellen über die Zeit Viabilitätsassays LDH-Test Bestimmung der Zytotoxizität mittels MTT-Test Spektroskopische Methoden Bestimmung der Proteinkonzentration von Zelllysaten Bestimmung der Proteinkonzentration von TmHU Analyse von TmHU mit ESI-Massenspektroskopie CD-Spektroskopie Strukturbestimmung von TmHU Schmelzpunktanalyse von TmHU und sirna Bindungsstudien von TmHU an sirna durch Messung der Fluoreszenzpolarisation Sonstige Methoden RNaseschutzanalyse von RNA Analytische Ultrazentrifugation Bestimmung des Endotoxingehalts von Proteinproben 59 3 ERGEBNISSE Vorbemerkungen Proteinherstellung von Wildtyp-TmHU Optimierung der Expressionsbedingungen im Maßstab Fermentation und Reinigung von TmHU Allgemeine biochemisch-physikochemische Charakterisierung des TmHU-Proteins Bestimmung der TmHU-Konzentration mittels Aminosäure-Analytik 64

6 IV Inhaltsverzeichnis Analyse der Reinheit und Konzentration von TmHU mit Reversed- Phase-Chromatographie und ESI-Massenspektrometrie Analyse der Struktur und des Schmelzpunktes von TmHU mittels CD-Spektroskopie Untersuchung des Assoziationsgrades von TmHU mittels Größenausschlusschromatographie Untersuchung des Assoziationsgrades von TmHU mittels analytischer Ultrazentrifugation Charakterisierung der Interaktion von TmHU und RNA RNaseschutzanalyse von RNA nach Bindung von TmHU Untersuchung der TmHU-RNA-Interaktion mittels Fluoreszenzpolarisation Schmelzpunktanalyse von sirna nach Interaktion mit TmHU mittels CD-Spektroskopie Untersuchung der Aufnahme und Lokalisation von TmHU in eukaryontischen Zellen Detektion von TmHU im Zelllysat eukaryontischer Zellen mittels Western-Blot-Analyse Untersuchung der Aufnahme von markiertem TmHU mittels Fluoreszenzmikroskopie Immunfluoreszenzfärbung von Zellen nach Inkubation mit TmHU Untersuchung der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen in eukaryontische Zellen Untersuchungen der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen mittels Fluoreszenzmikroskopie Untersuchungen der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie Untersuchung der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen mittels Durchflusszytometrie Transfektion von Nukleinsäuren mit TmHU Etablierung einer Positivkontrolle für die Transfektion von EGFPsiRNA Transfektion von EGFP-siRNA mit TmHU Untersuchung der Zytotoxizität von TmHU im Vergleich mit Lipofectamine LDH-Test MTT-Test Transfektionen mit Calcium Transfektion von humanen Zellen Zytotoxizität von Calciumchlorid Untersuchung des Aufnahmemechanismus von TmHU und TmHU-Nukleinsäure-Komplexen durch Inhibition der Endozytose Transfektionen mit dem Endosomenbrecher Chloroquin 91

7 Inhaltsverzeichnis V Etablierung einer Positivkontrolle für die Transfektion von pegfp-c Transfektion von Plasmid-DNA mit dem Endosomenbrecher Chloroquin und TmHU Sättigung des Plasmids mit TmHU Toxizität von Chloroquin Transfektion von humanen Zellen mit EGFP-Plasmiden mit unterschiedlicher Lokalisation des Produkts Transfektion von Plasmid pegfp und sirna Transfektion von sirna mit TmHU und Chloroquin in Zellen mit d2egfp-expression Transfektionen mit KALA Transfektionen mit dem endosomolytischen Peptid E Das endosomolytische Peptid E Kopplung von E5 an TmHU Transfektionen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E Untersuchung der Zytotoxizität von E5 und TmHU-E Vergleich mit anderen DNA-bindenden hyperthermophilen Proteinen DISKUSSION Expression und Reinigung von TmHU Allgemeine biochemisch-physikochemische Charakterisierung von TmHU Interaktion von TmHU und RNA Bindung von TmHU an RNA TmHU-vermittelter Schutz von RNA vor thermischer Denaturierung TmHU als Transfektionsagens Vorüberlegungen Aufnahme und Lokalisation von TmHU in eukaryontischen Zellen Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen in eukaryontische Zellen Transfektion von Nukleinsäuren mit TmHU Transfektionen mit Calcium Aufnahmemechanismus von TmHU Unterstützung der Transfektion mit endosomolytischen Substanzen Transfektionen mit dem Endosomenbrecher Chloroquin Transfektionen mit dem Peptid KALA Transfektionen mit dem endosomolytischen Peptid E Toxizität von TmHU Vergleich mit anderen thermostabilen DNA-bindenden Proteinen Abschließende Bemerkungen 133

8 VI Inhaltsverzeichnis 5 ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Plasmidkarten pgem-t-vektor (Fa. Promega) puc19-vektor (Fa. New England BioLabs) pet-11a-vektor (Fa. Novagen, Inc.) pet-17b-vektor (Fa. Novagen, Inc.) pegfp-c3-vektor (Fa. BD Biosciences, Clontech) pd2egfp-n1-vektor (Fa. BD Biosciences, Clontech) Abkürzungen Lebenslauf Tagungsbeiträge und Publikationen Danksagung Selbstständigkeitserklärung 160