Abkürzungsverzeichnis... VII. 1. Einleitung Regulation intrazellulärer Signalwege durch camp Optogenetische Methoden...

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1 I Abkürzungsverzeichnis... VII 1. Einleitung Regulation intrazellulärer Signalwege durch camp Optogenetische Methoden camp-abhängige Mechanismen synaptischer Plastizität Lokale Signalverarbeitung in primären Zilien camp-abhängige Regulation der Spermienfunktion Material & Methoden Material E.coli Zellkultur Verwendete Bakterienstämme und Plasmidvektoren Zusammensetzung und Herstellung von Kulturmedien für E.coli Anzucht von E.coli Bakterienkulturen zur Plasmidpräparation Herstellung kompetenter Zellen zur Transformation mit Plasmid-DNA Präparation von Nukleinsäuren Minipräparation von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse Midi- und Maxipräparation Präparation von genomischer DNA aus Mausgewebe Reinigung und Auftrennung von Nukleinsäuren Ethanol-Präzipitation Aufreinigung mit SureClean Photometrische Quantifizierung von DNA Quantifizierung von DNA im Agarosegel Agarose-Gelelektrophorese... 30

2 II Elution von DNA aus Agarosegelen Modifizierung von Nukleinsäuren Restriktion von Plasmid-DNA mit Restriktionsendonukleasen Ligation Transformation DNA-Sequenzierung Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primersynthese Bedingungen für die PCR-Reaktionen PCR-Reaktion zur DNA-Mutagenese Reinigung von PCR-Produkten Säugetierzellkultur Sterilarbeit Zelllinien Erhaltung und Splitting Kryokonservierung von Säugetierzellen Lipofektion Elektroporation Generation stabiler Zelllinien Präparation von Proteinen Proteinpräparationen aus Säugetierzellen Proteinpräparationen aus Mausgewebe Konzentrationsbestimmung mit Bicinchoninsäure (BCA) Trennung und Nachweis spezifischer Proteine Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Transfer und Immobilisierung von Proteinen mittels Western Blot Immunodetektion immobilisierter Proteinen Entfernung von primären und sekundären Antikörpern (Stripping)... 41

3 III 2.10 Immunfluoreszenz Immunzytochemie Anfertigen von Gefrierschnitten Immunhistochemie Antikörper Versuchstiere Haltung und Zucht Generation einer transgene Mauslinie durch pronukleäre Injektion Arbeiten mit Mausspermien Präparation von Mausspermien Proteinpräparation aus Mausspermien Analyse des Flagellenschlags In-vitro-Fertilisation Neuronale Primärzellkultur Präparation hippocampaler Primärzellen Transduktion durch rekombinante Adeno-assoziierte Viren (raav) Transfektion zur Herstellung von raavs Präparation und Aufreinigung von raavs Zeitaufgelöste Messungen von Ca 2+ und camp Beladung von Säugetierzellen mit fluoreszenten Ca 2+ -Indikatoren Fluoreszenzmessungen am FLUOstar Platereader Fluoreszenzmessungen auf Einzelzellebene camp Messungen mit einem FRET-basierten Biosensor FRET Messungen an Zellen in Suspension FRET Messungen auf Einzelzellebene Bestimmung der camp-menge in Mausspermien (CatchPoint Assay) Ergebnisse... 57

4 IV 3.1 Charakterisierung der bakteriellen photoaktivierten Adenylatzyklase (bpac) Herstellung der stabilen Zelllinie HEK-TM-bPAC Charakterisierung von bpac in Zellpopulationen Charakterisierung der bpac in Einzelzellen Expression von bpac in neuronaler Primärzellkultur Kultivierung und Transduktion primärer hippocampaler Neuronen Charakterisierung von bpac über den Ca 2+ Einstrom durch CNGA2-TM Design und Klonierung eines rotverschobenen FRET-Sensors für camp Charakterisierung des rotverschobenen FRET-Sensors targeting von bpac in primäre Zilien Vergleich von targeting-proteinen in MDCK-Zellen SSTR3 als targeting-protein in IMCD-3-Zellen targeting von bpac in neuronale Zilien Optogenetische Manipulation von camp in Mausspermien Generation der transgenen Mauslinie Prot1-bPAC Selektion von Founder-Linien und Nachweis der bpac-expression Lichtinduzierte camp-synthese in Prot1-bPAC Spermien Manipulation der flagellaren Schlagfrequenz durch Licht Einfluss der bpac-basalaktivität auf Prot1-bPAC Spermien Unspezifische Nebeneffekte membrangängiger camp-analoga Ersatz der SACY-Funktion durch bpac Generation der doppelt-transgenen Mauslinie snhe-ko/bpac Wiederherstellung von Motilität und Fertilität in snhe-ko/bpac-spermien Diskussion Manipulation zellulärer Funktionen mit Hilfe von bpac Funktionale Charakterisierung von bpac in neuronalen Primärzellen Manipulation der lokalen camp-konzentration in primären Zilien Optogenetische Kontrolle der Spermienfunktion... 96

5 V 5. Anhang Primersequenzen Abbildungsverzeichnis Literaturverzeichnis