Die gewebespezifische Genexpression in der Epidermis des Gerstenblattes

Transkript

1 Die gewebespezifische Genexpression in der Epidermis des Gerstenblattes Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Beate Hollenbach aus Heidelberg Würzburg, 1996

2 INHALTSVERZEICHNIS I.EINLEITUNG 1.1. Die Morphologie der Epidermis Der Aufbau der Cuticula Die Rolle der Epidermis aus ökophysiologischer Betrachtung UV-Schutz Gasaustausch Xenobiotika-Entgiftung Pathogenabwehr Physiologische Besonderheiten der Epidermis Enzymaktivitäten Sekundäre Metabolite Kompartimentierung von Nährstoffen Schwermetallstreß Abscisinsäure Ansätze zur molekularen Charakterisierung der Epidermis Zielsetzung dieser Arbeit 9 2. MATERIAL UND METHODEN 2.1. Pflanzenmaterial Anzucht in Erdkultur Anzucht in Hydrokultur Isolierung verschiedener Blattfraktionen Gewinnung von Epidermisstreifen Isolierung von Epidermis- und Mesophyllprotoplasten Aufreinigung von Epidermisprotoplasten Aufreinigung der Mesophyllprotoplasten Isolierung von Vakuoplasten Polyacrylamid-Gelektrophorese Proteinextraktion mit Phenol Proteinbestimmung mit BCA-Reagenz Zweidimensionale Gelelektrophorese Silberfärbung von Polyacrylamidgelen Transpirationsmessung 18

3 2.5. Wachsextraktion und Chromatographie Quantifizierung der Abscisinsäure (ABA) Aufbereitung und Reinigung von Extrakten ABA-Bestimmung mittels ELISA Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren Isolierung von Gesamtnukleinsäuren aus Pflanzenmaterial Isolierung von poly(a)*-mrna Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Phenolextraktion und Ethanolfällung Anlage und Durchmusterung einer cdna-bibliothek Die Anlage einer cdna-bibliothek Ausplattierung und Lagerung von Phagen Amplifizierung von Phagen-DNA Transfer von Phagen-DNA auf Nylonmembran Isolierung von Phagen DNA Präparation von Plasmiden aus Phagen-DNA In wvo-exzision Transformation von Bakterien und Isolierung der Plasmid-DNA Anzucht, Ausplattierung und Lagerung von Bakterien Herstellung kompetenter Zellen Transformation Präparation von Plasmiden Enzymatische Modifikation von DNA Spaltung mit Restriktionsendonukleasen Überführung überhängender in glatte Enden ( fill in") Dephosphorylierung Ligation DNA-Sequenzierung Z Agarose-Gelelektrophorese MOPS-Formaldehyd-Gelelektrophorese Agarose-Gelelektrophorese Elution von DNA-Fagmenten aus Agarose-Gelen Blotting-Verfahren Southern Blot Northern Blot Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren Radioaktive Markierung von DNA ( Oligolabelling") Radioaktive Markierung von mrna durch Erststrangsynthese 39

4 2.15. Hybridisierung /n s/fu-hybridisierung Fixierung Entwässerung/Einbettung Anfertigung von Schnitten Vorbereitung der Schnitte für die Hybridisierung Sondensynthese Hybridisierung der Schnitte ERGEBNISSE UND DISKUSSION 3.1. Methodische Grundlagen zur Isolierung von epidermisspezifischen Genen Durchmusterung einer cdna-bibliothek ( differentielles Screening") Modifizierung des differentiellen Screenings" EMIP, ein Wasserkanal der Epidermisplasmamembran Isolierung und Charakterisierung des Klons epi Analyse der Nukleotidsequenz und der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz von EMIP Hydropathiestudien und daraus abgeleitete Modellvorstellungen zur Membrantopologie Charakterisierung von EMIP als Mitglied der major intrinsic protein (MIP)-Familie " Die Charakteristika der MIP-Familie Struktur- und Funktionsbeziehung der MIP-Familie Transporteigenschaften der MIP-Familie Aminosäuresequenzvergleich von EMIP Anzahl der MlP-Vertreter im Pflanzenreich Analyse der Induktion von emip Nachweis der gewebespezifischen Expression von emip durch in situ Hybridisierungen Altersabhängigkeit der Expression von emip r Analyse der Streß-Induktion von emip, insbesondere unter Trockenstreß Hormonelle Induzierbarkeit von emip durch ABA Zusammenfassende Diskussion der Funktion des Wasserkanals (EMIP) in der Epidermis LTP7a2b ein Lipidtransferprotein der Epidermiszellwand Isolierung gewebespezifisch exprimierter cdna-klone durch ein modifiziertes differentielles Screening" Charakterisierung des Lipidtransferpjoteins LTP7a2b Analyse der Nukleotidsequenz und der daraus resultierenden Aminosäuresequenz des Lipidtransferproteins Vergleich von LTP7a2b mit anderen pflanzlichen Lipidtransferproteinen 78

5 IV Die Bedeutung der Lipidtransferproteine als Mitglieder von Multigenfamilien Beziehung von Struktur der Lipidtransferproteine und ihrer Funktion Spezifische Expression von Lipidtransferproteine und deren Induzierbarkeit durch Streß Gewebespezifische und altersabhängige Expression des LTP7a2b Regulationsmechanismen der Expression des LTP7a2b Abscisinsäure Trockenstreß Schwermetall-Toxizität Zusammenhang zwischen der Expression des LTP7a2b, ABA-Gehalt, Cadmium-Toxizität und der Wachsbelegungsdichte Die Bedeutung von ABA bei der Induktion von Itp7a2b bei Schwermetall-gestreßten Pflanzen Korrelation zwischen ABA-Gehalt und mrna-menge von Itp7a2b bei Cadmium-gestreßten Pflanzen Die Auswirkungen der Erhöhung des ABA-Gehalts bei Cadmiumgestreßten Pflanzen Cadmium-Streß induziert eine Veränderung der Cuticula Die mögliche Funktion von Lipidtransferproteinen ZUSAMMENFASSUNG 4.1. Charakterisierung der Expression des Wasserkanals EMIP (epidermai rnajor intrinsic p/otein) Die Expression des Lipidtransferp.roteins LTP7a2b in der Epidermis und dessen mögliche Funktion in der Cuticulasynthese ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS LITERATURVERZEICHNIS 104