I. Inhaltsverzeichnis I. II. Abbildunqsverzeichnis. III. Tabellenverzeichnis. IV. Abkürzunasverzeichnis. V. Zusammenfassung XIII. 1.

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Jonas Linden
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I. Inhaltsverzeichnis I II. Abbildunqsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Abkürzunasverzeichnis VII IX X V. Zusammenfassung XIII VI. Abstract XVIII 1. Einleitung 1 1.

1 I. Inhaltsverzeichnis I II. Abbildunqsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Abkürzunasverzeichnis VII IX X V. Zusammenfassung XIII VI. Abstract XVIII 1. Einleitung Zielstellung der Arbeit Stammzellen Embryonale Stammzellen Diabetes mellitus Diabetes bedingte Knochenfehlbildungen bei Erwachsenen und bei dem Embryo/Fötus Osteogenese Knochen Knochenentwicklung in vivo Osteoblastendifferenzierung in vivo Osteoklastendifferenzierung in vivo Osteogenese von embryonalen Stammzellen in vitro Wnt Signalweg Signaltransduktion im Wnt Signalweg Wnt Signalweg in der Osteogenese microRNAs Biogenese und Wirkmechanismus von micrornas Funktion von microrn As in Stammzellen und der osteogenen Differenzierung Material Chemikalien, Enzyme Kits Nährlösungen und Medien Puffer und übrige Lösungen 22

2 2.5 Zellen Oligonukleotide Antikörper Plasmid Verbrauchsmaterialien Geräte Methoden Zellkultur Kultur von undifferenzierten murinen embryonalen Stammzellen Kultur von embryonalen Fibroblasten - Feeder Zellen Kultur von undifferenzierten embryonalen Stammzellen des Rhesusaffen Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen unter Nutzung des Hängenden Tropfen Protokolls Differenzierung von embryonalen Stammzellen des Rhesusaffen Einfrieren und Auftauen der Zellen Behandlung der mesc mit den Inhibitoren LiCI und LY Transfektion von mescs mit Effectene RNA-Expressionsanalysen Aufreinigung von RNA mit einem RNA Purification Kit Aufreinigung von RNA durch Phenol-Chloroform Fällung DNAse Verdau cdna-synthese für RT-PCR und quantitative PCR für mirna Expressionsanalysen für GeXP Multiplex PCR PCR Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) Quantitative PCR mit Sybr Green (mrna und mirna) GeXP Multiplex PCR 37

3 3.2.6 Agarose-Gelelektrophorese MicroArray zur Analyse der mirna Expression Protein-Expressionsanalysen Durchflusszytometrische Messungen ELISA Extraktion nukleare und cytoplasmatische Proteine Proteinbestimmung SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Western Blot Immunpräzipitation Biochemische Analysen Zelllyse Aktivitätsmessungen der tartrat-resistenten sauren Phosphatase Bestimmung der Kalziumkonzentration Annexin-FITC-/Propidiumiodid-Färbung (Apoptose-Assay) Morphologische Analysen Phasenkontrast und Durchlichtaufnahmen Immunfluoreszenzfärbungen Alizarinrotfärbung van Gieson Färbung Osteoklastenfärbung Fettzellfärbung Klonierung Annealing Restriktionsverdau Ligation Transformation Colony PCR Maxi Plasmid Präparation Statistische Analysen 49

4 4. Ergebnisse Einfluss von Glucose auf die Pluripotenz von murinen embryonalen Stammzellen Einfluss von Glucose auf die osteogene Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen - Kultivierungsbedingungen Einfluss von Glucose auf die Ausbildung von Osteoblasten Morphologie der extrazellulären Matrix Matrixkalzifizierung mrna Expression osteoblastenspezifischer Genen Entwicklung einer Multiplex PCR zur Messung der Genexpression während der osteogenen Differenzierung Expression von osteoblastenspezifischen Transkripten Einfluss von Glucose auf die OCN Expression Einfluss von Glucose auf den ph Wert des mesc Kulturmediums Einfluss von Glucose auf die Osteoklastendifferenzierung muriner embryonaler Stammzellen Morphologie Aktivitätsmessung der tartrat-resistenten sauren Phosphatase mrna Expression von osteoklastenspezifischen Genen RANKL/OPG Verhältnis Einfluss von Glucose auf die frühe Differenzierung bis Tag Bildung von mesodermalen und hämatopoetischen Zellen Regulation der nukleären beta-catenin Aktivität mit seinen Interaktionspartnern LEF-TCF und F0X03a Expression von F0X03a Zielgenen Inhibitorstudien Einfluss von Glucose auf die Bildung von Chondrozyten und Adipozyten in osteogen induzierten ESC Differenzierungen Einfluss von Glucose auf die Bildung von Adipozyten Einfluss von Glucose auf die Bildung von Chondrozyten Einfluss von Glucose auf die Genexpression von spezifischen Markern des Endo- und Ectoderms Einfluss von Glucose auf die Differenzierung von embryonalen Stammzellen des Rhesusaffen 88

5 4.10 Beteiligung von micrornas in der osteogenen Differenzierung von mescs MicroArray Analysen Potentielle Zielgene Validierung der mirna Expressionen und Überexpressionsstudien mmu-mir Expression der mmu-mir Überexpression der mmu-mir mmu-mir-125b-5p Expression der mmu-mir-125b-5p Überexpression der mmu-mir-125-5p mmu-mir-199a-5p Expression der mmu-mir-199a-5p Überexpression der mmu-mir-199a-5p mmu-mir Expression der mmu-mir Überexpression der mmu-mir mmu-mir-466a-3p Expression der mmu-mir-466a-3p Überexpression der mmu-mir-466a-3p Diskussion Einfluss von Glucose auf die Pluripotenz der ESCs Einfluss von Glucose auf die osteogene Differenzierung von ESCs Einfluss von Glucose auf die Osteoblastendifferenzierung Einfluss von Glucose auf die Osteoklastendifferenzierung Übertragbarkeit der Ergebnisse von mesc auf rescs Einfluss von Glucose auf die beta-catenin und F0X03a Aktivität während der frühen Differenzierung Einfluss von Glucose auf die spontane Differenzierung von mescs Einfluss von Glucose auf die Adipozyten-und Chondrozytendifferenzierung Einfluss von Glucose auf die Differenzierung endo- und ectodermaler Zellen. 134

6 5.5 Funktion und Regulation von mirnas in der osteogenen Differenzierung unter verschiedenen Glucosekonzentrationen Einfluss von Glucose auf die mirna Expression während der osteogenen Differenzierung Einfluss von mirnas auf die osteogene Differenzierung Funktion der mir-466a-3p Zusammenfassung, Schlussfolgerung und Ausblick Referenzen 141 VII. Anhang VIII. Tabellarischer Lebenslauf IX. Danksagung XXII XXVIII XXXI

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