1 Zusammenfassung 1. 2 Einleitung Chemische Genetik Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion 7

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Jan Hafner
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung 3 2.1 Chemische Genetik 4 2.2 Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion 7 2.3 Guaninnukleotid-bindende Proteine (G-Proteine/GTPasen) 7 2.3.1 Kleine GTPasen 8 2.

1 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung Chemische Genetik Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion Guaninnukleotid-bindende Proteine (G-Proteine/GTPasen) Kleine GTPasen Regulatoren der kleinen GTPasen: GEFs, GAPs und GDIs Guaninnukelotid-Austauschfaktoren (GEFs) GTPase aktivierende Proteine (GAPs) Guaninnukelotid-Dissoziationsinhibitoren (GDIs) Phosophatidylinositol-Polyphosphate (PIP ) Pleckstrin-Homologie-Domänen Cytohesine Cytohesine als GEFs der Arf-GTPasen Cytohesine reguliern die ß 2-lntegrin vermittelte Adhäsion: Inside-Out-Signaling Vorarbeiten zur Etablierung einer neuen Klasse niedermolekularer Inhibitoren für die Cytohesin PH-Domäne Selektion eines bindenden Aptamers für die Cytohesin-1 PH-Domäne Identifizierung einer Leitstruktur potentieller niedermolekularen Inhibitoren für die Cytohesin PH-Domäne 23 3 Zielsetzung 25 4 Ergebnisse Synthese der Cyplecksine und ihrer inaktiven Derivate Untersuchung der Bindungsaffinität der Cyplecksine an die Cytohesine im MicroScale-Thermophorese (MST)-Assay Untersuchung des inhibitorischen Effekts der Cyplecksine im Fluoreszenz- Polarisations (FP)-Assay Bindung von Cytohesin-Konstrukten im Fluoreszenz-Polarisations-Assay an FL- PIP 3 oder TMR-PIP2 30

2 4.3.2 Inhibitorischer Effekt der Cyplecksine im FP-Assay Spezifitätsuntersuchungen der Cyplecksine zu der Pleckstrin-Homologie-Domäne der Cytohesine Spezifitätsuntersuchungen im MST-Assay Spezifitätsuntersuchungen im FP-Assay Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) der Cyplecksine Einfluss von Modifikationen an Position N1 auf die Aktivität der Cyplecksine: Gruppe Nl-Ri Einfluss von Modifikationen an Position C5 auf die Aktivität der Cyplecksine: Gruppe C5-R 2 ; Einfluss von Modifikationen an Position C5 auf die Aktivität der Cyplecksine: Gruppe C5-X Untersuchung einer kovalenten Bindung der Cyplecksine an die PH-Domäne der Cytohesine Mechanistische Studien der kovalenten Bindung von Cyplecksinen an die Cytohesine: Nukleophile Addition an Cyplecksine Zelluläre Untersuchung des inhibitorischen Effekts der Cyplecksine im Membrantranslokations-Assay in HeLa-Zellen Einfluss der Cyplecksine auf Protein-Protein-Interaktionen der Cytohesin PH- Domäne Einfluss der Cyplecksine auf die Interaktion der Cytohesin-1 PH-Domäne mit dem intrazellulären Konstrukt des Insulin-Rezeptors (ICD-IR) Einfluss der Cyplecksine auf die Interaktion der Cytohesin-1 PH-Domäne mit der Aldolase 64 5 Diskussion Cyplecksine sind Inhibitoren der Cytohesin PH-Domäne Spezifität der Cyplecksine zur PH-Domäne der Cytohesine Struktur-Wirkungs-Beziehungen der Cyplecksine Cyplecksine binden kovalent an die Cytohesin PH-Domäne Cyplecksine als Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen der PH- Domäne 80 6 Ausblick 82 7 Material und Methoden Material Geräte 85

3 7.1.2 Verbrauchsmaterialien Chemikalien Standards und Kits Plasmide und kommerziell erworbene Enzyme Bakterien Eukaryotische Zelllinien Antikörper Methoden Synthese Allgemeine Vorschrift zur Synthese von Pyrimidin-2,4,6-trion-Derivaten (S1-2J l-benzylpyrimidin-2,4,6-trion (Ri = Benzyl, R2 = H; Sl) l-(4-chlorophenyl)pyrimidin-2,4,6-trion (R2 = 4-Chlorophenyl, R2 = H; S2) Allgemeine Vorschrift zur Synthese von Benzylidenpyrimidin-2,4,6-trion- Derivaten (E/Z)-5-(4-Chlorobenzyliden)-l-(4-chlorophenyl)pyrimidin-2,4,6-trion (Rj = 4-Chlorophenyl, R2 = 4-Chlorophenyl; MH 40-A) (E/Z)-5-Benzyliden-l-(4-chlorophenyl)pyrimidine-2,4,6-trion (R2 = 4-Chlorophenyl, R2 = Phenyl; MH 119) (E/Z)-l-Benzyl-5-benzylidenpyrimidin-2,4,6-trion (Rx = Benzyl, R2 = Phenyl; MH 32-A) Allgemeine Vorschrift zur Synthese von Benzylpyrimidin-2,4,6-trion-Derivaten l-(4-chlorophenyl)-5-benzylpyrimidin-2,4,6-trion (MH 120) l,5-dibenzylpyrimidin-2,4,6-trion (MH 32-B) (4-chlorobenzyl)-l-(4-Chlorophenyl)pynmidin-2,4,6-trion (MH 40-B) Allgemeine Vorschrift zur Synthese von 5-Bromopyrimidin-2,4,6-trion-Derivaten l,5-dibenzyl-5-bromopyrimidin-2,4,6-trion (Cyplecksin 1) Benzyl-5-bromo-l-(4-chlorophenyl)pyrimidin-2,4,6-trion (Cyplecksin 2) (4-Chlorobenzyl)-5-bromo-l-(4-chlorophenyl)pyrimidin-2,4,6-trion (Cyplecksin 3) Synthese von 5-Benzyl-5-chloro-l-(4-chlorophenyl)pyrimidin-2,4,6-trion (JH Cl- Cypl.2) Synthese von 5-Bromo-5-cyclohexylmethyl-l-(4-chlorophenyl)pyrimidin-2,4,6- trion (MH 128-Br) Synthese der biotinylierten Derivate (MH 116, MH 117) l-(4-hydroxyphenyl)kohlensäurediamid (S3) l-(4-(prop-2-ynyloxy)phenyl)kohlensäurediamid (S4) Benzyl-l-(4-(prop-2-ynyloxy)phenyl)pyrimidin-2,4,6-trion (S5) Benzyl-5-bromo-l-(4-(prop-2-ynyloxy)phenyl)pyrimidin-2/4,6-trion (MH 60-Br) N-(2-Azidoethyl)-5-(2-oxohexahydro-lH-thien[3,4-d]imidazol-4-yl) pentanamide (S6) Allgemeine Vorschrift zur Synthese der biotinylierten Derivate (MH 116, MH 117) Proteinarbeiten 107

4 Transofrmation der Plasmide in E.coli Proteinexpression in E.coli Proteinaufreinigung Affinitätschromatographie Präparative Gelfiltration Umpufferung und Lagerung Konzentrationsbestimmung Photometrische Bestimmung nach Bradford Photometrische Bestimmung nach Lambert-Beer SDS-PAGE und Comassie-Färbung Transfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen (Western-Blot) Immunologische Detektion von Proteinen Fluorophor-Markierung von Proteinen In vitro Methoden MicroScale-Thermophorese (MST) Fluoreszenz-Polarisations-Assay Detektion der kovalenten Bindung Eukaryotische Zellkultur-Arbeiten Allgemeiner Umgang mit eukaryotischen Zelllinien Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität Zellfixierung Membrantranslokations (MT)-Assay in HeLa Anhang Liste der verwendeten Moleküle Bindung von Barbital in MST an Cytohesin-1 PH Effekt der Verbindungen MH 32-A und MH 119 im FP-Assay lodoacetamid-effekt auf die Cyplecksin-Aktivität im FP-Assay Löslichkeit der Cyplecksine in 2%-DMSO-haltigen FP-Puffer Bindung von PH domänen an PIP 3 oder PIP 2 im FP LC-MS Analysen für die Detektion der Addition von Methanol an verschiedenen Derivaten Vollständige Blots der Untersuchung der kovalenten Bindung 132

5 8.8.1 Bindung der biotinylierten Proben an Cytohesin-1 PH, Cytohesin-2 Sec7 und BSA Bindung der biotinylierten Proben an Volllängenkonstrukt-Cytohesin-1 (Cythl-fl), Cytohesin-2 Sec7 und BSA Kompetition der biotinylierten Probe MH 116 durch Cyplecksine Zellaufnahmen im Konfokal-Mikroskop Kontrollzellen unstimuliert (ohne Insulin) Kontrollzellen stimuliert (mit Insulin) Stimulierte Zellen behandelt mit Cyplecksin Stimulierte Zellen behandelt mit Cyplecksin Stimulierte Zellen behandelt mit Cyplecksin Stimulierte Zellen behandelt mit MH 40-A Stimulierte Zellen behandelt mit MH 40-B Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf 165

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