ENZYMATISCHE GRUNDLAGEN DER AKTIVIERUNG DES AMIDOXIM- UND ESTER- PRODRUGS XIMELAGATRAN

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1 ENZYMATISCHE GRUNDLAGEN DER AKTIVIERUNG DES AMIDOXIM- UND ESTER- PRODRUGS XIMELAGATRAN Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vorgelegt von KATRIN LOPIAN Kiel 2002

2 1 EINFUHRUNG BIOTRANSFORMATION DEFINITION UND BEDEUTUNG BIOTRANSFORMATIONSSTUDIEN ENZYME DER BIOTRANSFORMATION Allgemein Das Cytochrom P450 Enzymsystem Vorkommen und Bedeutung Der katalytische Zyklus BIOTRANSFORMATION STICKSTOFFHALTIGER FUNKTIONELLER GRUPPEN Allgemein Benzamidoxim-Reduktase-System THERAPEUTISCHE BEDEUTUNG VON AMIDINEN UND AMIDOXIMEN ALLGEMEINE GRUNDLAGEN ANTITHROMBOTISCH WIRKSAME ARZNEISTOFFE Übersicht Gerinnungssystem Übersicht Antithrombotika Thrombozytenaggregationshemmer Antikoagulantien Faktor Xa-Inhibitoren Thrombininhibitoren THEMA UND ZIELSETZUNG 43 2 IN VITRO BIOTRANSFORMATION VON XIMELAGATRAN UND /V-HYDROXY-MELAGATRAN EINLEITUNG THERAPEUTISCHE BEDEUTUNG VON MELAGATRAN Pharmakodynamik Pharmakokinetik BEDEUTUNG VON AMIDOXIMEN ALS PRODRUGS - PRINZIP DES DOPPEL-PRODRUGS XIMELAGATRAN ZIELSETZUNG Methoden GEWINNUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN AUS LEBER, NIERE UND GEHIRN 54 I

3 Materialien Geräte Gewinnung von Mikrosomen Humane Leber-und Nierenmikrosomen Leber-,Nieren- und Hirnmikrosomen aus dem Schwein Gewinnung von Mitochondrien Humane Leber- und Nierenmitochondrien Leber- und Nierenmitochondrien aus dem Schwein Isolierung der Komponenten des rekonstituierten Systems aus Schweine- Lebermikrosomen Isolierung der Benzamidoxim-Reduktase (CYP2D) und Cytochrom b Isolierung der NADH-Cytochrom b 5 Reduktase Isolierung der Komponenten des rekonstituierten Systems aus Schweine- Lebermitochondrien Isolierung der 3. Komponente des Benzamidoxim-Reduktase-Systems Isolierung der mitochondrialen NADH-Cytochrom b 5 Reduktase Isolierung von mikrosomalem Cytochrom b CHARAKTERISIERUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN Bestimmung des Proteingehaltes Bestimmung des Cytochrom P450-Gehaltes NADH-Cytochrom b 5 Reduktase-Aktivitätsbestimmung Gehaltsbestimmung von Cytochrom b REDUKTION VON /V-HYDROXY-MELAGATRAN ZU MELAGATRAN Materialien und Geräte Stabilitätsprüfung von /V-Hydroxy-Melagatran In vitro Biotransformationsansätze Mikrosomale und mitochondriale Enzympräparationen Mikrosomales rekonstituiertes System (Schwein) Mitochondriales rekonstituiertes System (Schwein) HPLC-Analytik zur Trennung von /V-Hydroxy-Melagatran und Melagatran Kalibrierung und Wiederfindung Ermittlung der Bestimmungsgrenze AKTIVIERUNG VON XIMELAGATRAN ÜBER INTERMEDIÄRMETABOLITE zu MELAGATRAN Materialien und Geräte Stabilitätsprüfung von Ximelagatran In vitro Biotransformationsansätze 68 II

4 Mikrosomale und mitochondriale Enzympräparationen Mikrosomales rekonstituiertes System (Schwein) Mitochondriales rekonstituiertes System (Schwein) HPLC-Analytik zur Trennung von Ximelagatran, Ethyl-Melagatran, /V-Hydroxy- Melagatran und Melagatran Kalibrierung und Wiederfindung Ermittlung der Bestimmungsgrenze HPLC-Analytik zur Trennung von Ximelagatran und Ethyl-Melagatran Kalibrierung und Wiederfindung Ermittlung der Bestimmungsgrenze ESTERHYDROLYSE VON XIMELAGATRAN ZU /V-HYDROXY-MELAGATRAN Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze Unspezifische Carboxyl-Esterasen aus Schweineleber Rekonstituiertes System HPLC-Analytik zur Trennung von Ximelagatran und /V-Hydroxy-Melagatran MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG EINES SYNTHESE-NEBENPRODUKTES VON XIMELAGATRAN LC/ MS-Analytik zur Trennung von Ximelagatran und Metaboliten LC/ MS-Analytik Zur Trennung von Ximelagatran und Ethyl-Melagatran Ergebnisse SPEZIFISCHE CYTOCHROM P450-GEHÄLTER REDUKTION VON/V-HYDROXY-MELAGATRAN zu MELAGÄTRAN Stabilitätsprüfung von /V-Hydroxy-Melagatran Kalibrierung und Wiederfindung Charakterisierung der Reduktion mit mikrosomalen und mitochondrialen Enzympräparationen Kinetik der Reduktion von /V-Hydroxy-Melagatran Einfluß der Proteinkonzentration Einfluß der Inkubationszeit Einfluß der Cosubstratkonzentration ph-wert-abhängigkeit Substratabhängigkeit Inkubationen im mikrosomalen rekonstituierten System (Schwein) Inkubationen im mitochondrialen rekonstituierten System (Schwein) 94 III

5 2.3.3 AKTIVIERUNG VON XIMELAGATRAN ÜBER INTERMEDIÄRMETABOLTTEN ZU MELAGATRAN Stabilitätsprüfung von Ximelagatran Kalibrierung und Wiederfindung von Ethyl-Melagatran, /V-Hydroxy-Melagatran und Melagatran Charakterisierung der Aktivierung von Ximelagatran mit mikrosomalen und mitochondrialen Enzympräparationen Kinetik der Gesamtaktivierung von Ximelagatran Einfluß der Proteinkonzentration Einfluß der Inkubationszeit Einfluß der Cosubstratkonzentration ph-wert-abhängigkeit Substratabhängigkeit /V-REDUKTION VON XIMELAGATRAN ZU ETHYL-MELAGATRAN Kalibrierung und Wiederfindung Inkubationen im mikrosomalen rekonstituierten System (Schwein) Inkubationen im mitochondrialen rekonstituierten System (Schwein) ESTERHYDROLYSE VON XIMELAGATRAN ZU /V-HYDROXY-MELAGATRAN Kalibrierung und Wiederfindung Charakterisierung der Esterhydrolyse von Ximelagatran mit unspezifischen Carboxyl-Esterasen Kinetik der enzymatischen Esterhydrolyse von Ximelagatran Einfluß der Proteinkonzentration Substratabhängigkeit Zeitabhängigkeit "' Einfluß des ph-wertes Inkubationen im rekonstituierten System mit CYP3A MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG EINES SYNTHESE-NEBENPRODUKTES VON XIMELAGATRAN Diskussion REDUKTION VON /V-HYDROXY-MELAGATRAN AKTIVIERUNG VON XIMELAGATRAN ÜBER INTERMEDIÄRMETABOUTE ZU MELAGATRAN REDUKTION VON XIMELAGATRAN ZU ETHYL-MELAGATRAN ESTERHYDROLYSE VON XIMELAGATRAN ZU /V-HYDROXY-MELAGÄTRAN Zusammenfassung 136 IV

6 3 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN DER BIOTRANSFORMATION VON AMIDOXIM-PRODRUGS Einleitung ZIELSETZUNG Methoden GEWINNUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN Mikrosomen aus Leber und Niere (Mensch, Schwein) Mitochondrien aus Leber und Niere (Mensch, Schwein) g-Überstände von Leber, Niere (Mensch, Schwein) und Cytosol CHARAKTERISIERUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN Bestimmung des Proteingehaltes REDUKTION VON RO zu RO Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Analytik zur Trennung von RO und RO REDUKTION VON /V-HYDROXY-MELAGATRAN ZU MELAGATRAN Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Analytik zur Trennung von /V-Hydroxy-Melagatran und Melagatran AKTIVIERUNG VON SIBRAFIBAN ÜBER RO UND RO A-E zu RO Materialien und Geräte Synthese des Intermediärmetaboliten RO A-E (Amidin-Ester) In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Analytik zur Trennung von Sibrafiban, RO , RO A-E, RO AKTIVIERUNG VON XIMELAGATRAN ÜBER INTERMEDIÄRMETABOLITE ZU MELAGATRAN Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Analytik zur Trennung von Ximelagatran, Ethyl-Melagatran, /V-Hydroxy- Melagatran und Melagatran Ergebnisse REDUKTION VON RO UND /V-HYDROXY-MELAGATRAN Kalibrierung und Wiederfindung von RO Kalibrierung und Wiederfindung von Melagatran Vergleich der Reduktion mit unterschiedlichen Enzympräparationen AKTIVIERUNG DER DOPPEL-PRODRUGS SIBRAFIBAN UND XIMELAGATRAN 153 V

7 Kalibrierung und Wiederfindung von RO A-E, RO und RO Kalibrierung und Wiederfindung von Ethyl-Melagatran, /V-Hydroxy-Melagatran und Melagatran Vergleich der Aktivierung zweier Doppel-Prodrugs Diskussion Zusammenfassung ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER 3. KOMPONENTE DES HUMANEN BENZAMIDOXIM-REDUKTASE-SYSTEMS Einleitung STAND DER VORARBEITEN VORKOMMEN UND BEDEUTUNG VON CYP2A ZIELSETZUNG, Methoden GEWINNUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN Materialien und Geräte Gewinnung humaner Lebermikrosomen Isolierung von CYP2A6 aus humanen Lebermikrosomen Hydrophobe Interaktionschromatographie an Octyl-Sepharose CL 4B Anionenaustausch-Chromatographie an Hydroxylapatit Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Cellulose Entfernung des Detergenz Detergenzentfernung über Hydroxylapatit Detergenzentfernung durch Calbiosorb Isolierung von rekombinant exprimiertem CYP2A6 aus Hefezellen Solubilisation der Hefezellen Anionenaustausch-Chromatographie Kationenaustausch-Chromatographie an CM-Sepharose Detergenzentfernung BIOCHEMISCHE METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN Bestimmung des Proteingehaltes Bestimmung des Cytochrom P450-Gehaltes SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) Materialien und Geräte 178 VI

8 Lösungen Zusammensetzung der Gele Probenvorbereitung Elektrophorese Färbung mit Coomassie Brillant Blue R Western-Blot Materialien und Geräte Lösungen Probenvorbereitung Blotting und Detektion Aminosäuresequenz-Analyse mittels MALDI-MS AKTIVITÄTSBESTIMMUNGEN DER HUMANEN ENZYMPRÄPARATIONEN Cumarin 7-Hydroxylierung Materialien und Geräte Fluorimeter HPLC In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Analytik Reduktion von Benzamidoxim Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze Rekonstituiertes System mit gereinigtem CYP2A6, in Hefezellen rekombinant exprimiertem CYP2A6 und humanen Lebermikrosomen Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimiertem CYP3A Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimiertem CYP2C Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimierter UGT2B HPLC-Analytik der Reduktion von Benzamidoxim Hemmstudien mit einem monoklonalen Antikörper gegen CYP2A Inhibitorstudien der Reduktion von /V-Hydroxy-Melagatran Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Analytik zur Trennung von /V-Hydroxy-Melagatran und Melagatran Reduktion von Ximelagatran und /V-Hydroxy-Melagatran Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze Rekonstituiertes System mit gereinigtem CYP2A6 191 VII

9 Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimiertem CYP3A Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimiertem CYP2C Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimierter UGT2B HPLC-Analytik Reduktion von RO Materialien und Geräte In vitro Biotransformationsansätze HPLC-Anaiytik der Reduktion von RO Ergebnisse ISOLIERUNG VON CYP2A6 AUS HUMANEN LEBERMIKROSOMEN Gewinnung humaner Lebermikrosomen Isolierung von CYP2A HIC an Octyl-Sepharose CL 4B ' Anionenaustausch-Chromatographie an Hydroxylapatit Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Cellulose r ISOLIERUNG VON REKOMBINANT EXPRIMIERTEM CYP2A6 AUS HEFEZELLEN CHARAKTERISIERUNG DER ENZYMPRÄPARATIONEN Überprüfung von Identität und Reinheit mittels SDS-Page und Western-Blot Isoliertes CYP2A6 aus humanen Lebermikrosomen Isoliertes CYP2A6 aus Hefezellen Aminosäuresequenz-Analyse mittels MALDI-MS AKTIVITÄTSBESTIMMUNGEN DER ISOLIERTEN ENZYMFRAKTIONEN Cumarin 7-Hydroxylierung Reduktion von Benzamidoxim Hemmstudien mit monoklonalen Antikörpern gegen CYP2A Inhibitorstudien der Reduktion von /V-Hydroxy-Melagatran an humanen Lebermikrosomen Inhibitorstudie mit pa/3-hydroxymercuribenzoat Inhibitorstudie mit Kaliumcyanid Inhibitorstudie mit Diethyldithiocarbamat Inhibitorstudie mit 8-Methoxypsoralen Inhibitorstudien mit Cimetidin und Clotrimazol Inhibitorstudie mit Ticlopidin Reduktion von Ximelagatran und /V-Hydroxy-Melagatran Rekonstituiertes System mit aus humanen Lebermikrosomen isoliertem CYP2A6 220 VIII

10 Rekonstituiertes System mit rekombinant exprimiertem, gereinigtem CYP3A4, CYP2C19 und UGT2B Reduktion von RO im rekonstituierten System mit aus humanen Lebermikrosomen isoliertem CYP2A Diskussion Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK LITERATURVERZEICHNIS 239 IX