Hyperforin aktiviert TRP-Kanäle - ein neuer antidepressiver. Wirkmechanismus? Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
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- Daniel Böhme
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1 Hyperforin aktiviert TRP-Kanäle - ein neuer antidepressiver Wirkmechanismus? Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften Vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang- Goethe-Universität in Frankfurt am Main Von Apothekerin Kristina Leuner geb. Treiber aus Ludwigshafen Frankfurt, am Main 2005
2 EINLEITUNG Depressionen Allgemeines Medikamentöse Therapie von Depressionen Sekundäre Effekte von Antidepressiva Hypericum perforatum Hyperforin, der wichtigste antidepressiv-wirksame Inhaltsstoff von Hypericum perforatum Die chemische Struktur der Phloroglucinole Pharmakokinetik der Phloroglucinole Experimentelle Pharmakodynamik der Phloroglucinole Die Hyperforin und Adhyperforin-vermittelte Wiederaufnahme- Hemmung ist nicht-kompetitiv Hyperforin induziert einen Na*"-Influx in humanen Thrombozyten Effekte von Hyperforin auf die Neurotransmission in vitro Verhaltenspharmakologische Studien mit Hyperforin Nicht selektive Kationenkanäle TRP-Kanäle Die Struktur der TRP-Kanäle TRPC-Kanäle Aktivierung der TRPC-Kanäle Pharmakologische Eigenschaften und elektrophysiologische Eigenschaften von TRPC-Kanälen TRPC1 TRPC2 TRPC3, 6 and 7 TRPC4 und 5 Die Rolle der TRPC-Kanäle in der neuronalen Entwicklung und Plastizität ZIELSETZUNG 46
3 MATERIAL UND METHODEN Material Geräte und Materialien Chemikalien Puffer und Lösungen Puffer Lösungen Verwendete Zellsysteme Dissoziierte Mausneurone Humane Thrombozyten Zellkultur PC12-Zellen HEK Zellen Transfektion von HEK293-Zellen mit TRPC Spektralphotometrische Bestimmung von intrazellulären lonenkonzentrationen Allgemeine Grundlagen Intrazelluläre Ca 2+ -Bestimmung Fura Fluo Beladung der unterschiedlichen Zellsysteme mit den Ca 2 *-Fluoresenz- Farbstoffen Intrazelluläre Na*-Bestimmung ^ Beladung der unterschiedlichen Zellsysteme mit SBFI Fluoreszenzmessung ^ Kalibration der Fluoreszenzsignale Intrazelluläre Ba 2 * und Sr 2 * Bestimmung Westernblot Analysen 3.5 Konfokale Mikroskopie Neurotransmitter-Wiederaufnahme-Studien Prinzip 70 70
4 Radioaktive Messung Statistische Auswertung 72 4 ERGEBNISSE Effekte von Hyperforin auf [Na*]i in unterschiedlichen neuronalen Zellmodellen Dissoziierte Mausneurone PC12-Zellen Effekte von Hyperforin auf die [Ca 2+ ]i in unterschiedlichen neuronalen Zellmodellen Dissoziierte Neurone PC12-Zellen Aktiviert Hyperforin nicht selektive Kationenkanäle (NSCC) in unterschiedlichen neuronalen Zellmodellen? Effekte des NSCC-lnhibitors SK&F auf den Hyperforin induzierten Na + -und Ca^-Einstrom in unterschiedlichen neuronalen Zellmodellen Dissoziierte Neurone PC12-Ze(len Effekte des NSCC-Blockers LOE 908 auf den Hyperforin induzierten Na*-und Ca 2 *- Influx in unterschiedlichen neuronalen Zetlmodellen Dissoziierte Neurone PC12-Zellen Sind SOCCs an dem Hyperforin induzierten Ca 2+ -Einstrom beteiligt? Effekte von Hyperforin auf [Ca 2+ ], in Ca 2t -freiem Medium Dissoziierte Neurone PC12-Zellen Hemmt eine Entleerung der intrazellulären Ca 2t -Speicher durch Thapsigargin den Hyperforin induzierten Ca 2+ -lnflux in
5 unterschiedlichen neuronalen Zellmodellen und welchen Effekt hat 2- Aminoethoxydiphenyl-Borat? Effekte von Thapsigargin auf den Hyperforin induzierten Ca 2t -lnflux in dissoziierten Neuronen Effekte von Thapsigargin auf den Hyperforin induzierten Ca 2 Mnflux in PC12-Zellen Effekte von 2-APB auf den Hyperforin induzierten Ca 2t -lnflux in dissoziierten Neuronen und PC12-Zellen Sind Ryanodin-Rezeptoren an dem Hyperforin-vermittelten Ca 2+ -lnflux beteiligt? Gibt es eine mitochondriale Komponente des Hyperforin induzierten Ca z+ Influxes? Effekte von CGP auf den Hyperforin induzierten Ca 2 *-lnflux an dissoziierten Mausneuronen und PC12-Zellen Aktiviert Hyperforin spannungsabhängige Kationenkanäle? M 46.1 Effekte von Tetrodotoxin auf den Hyperforin induzierten Ca 2+ -Einstrom Effekte von Verapamil auf den Hyperforin induzierten Ca 2 *-Einstrom Effekte von Omega-Conotoxin auf den Hyperforin induzierten Ca 2+ Einstrom Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse 9 ß 48 Genauere Untersuchungen der Effekte von Hyperfbrin auf die intrazelluläre Na + - und Ca 2+.Konzentration « Aktiviert Hyperforin TRP-Kanäle in PCi2-Zellen Effekte von Gadolinum auf den Hyperforin induzierten Ca 2t - und Na*- Influx in PC12-Zellen Effekte von Lanthan auf den Hyperforin induzierten Ca 2t - und Na + - lnfluxinpc12-zellen Effekte von Flufenaminsäure auf den Hyperforin induzierten Ca 2t - und Na* Influx in PC12-Zellen Effekte von Ruthenium Red auf den Hyperforin induzierten Ca 2t Influx
6 Induziert Hyperforin in PC12-Zellen einen unselektiven Kationeninflux? 107 Welchen Effekt besitzen die TRP-Kanal-Inhibitoren auf den Hyperforin induzierten Ba 2+ -lnffux 108 Welchen Effekt haben die TRP-Kanat-Inhibitoren auf den Hyperforinvermittelten Sr^-Influx 109 Heben die TRP-Kanal-Blocker auch die Hyperforin induzierte Seroton in-wiederaufnahme-hemmung auf? 109 Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse 111 Aktiviert Hyperforin Tyrosinkinase Rezeptoren in PC12-Zellen Aktiviert Hyperforin TRPC-Kanäle über die PLC? Effekte des aktiven und des inaktiven PLC-Inhibitors U73122 und 118 U73343auf den Hyperforin induzierten Ca 2T -lnf1ux an PC12-Zellen Effekte des PLC-Aktivators m-3m3fbs im Vergleich mit Hyperforin auf die intrazelluläre Ca 2 *- und Na*- Konzentration in PC12-Zellen Ist DAG an dem Hyperforin aktivierten Ca 2 *- und Na*- Influx in PC12-Zellen beteiligt? Effekte von OAG auf die intrazelluläre Na* und Ca 2 * Konzentration in PC12-Zellen Welchen Effekt hat eine Vorinkubation mit OAG auf den Hyperforin induzierten Ca 2 *- und Na*-Influx Ist die Proteinkinase C an der Aktivierung der TRP-Kanäle beteiligt? Hemmt PMA den Hyperforin induzierten Ca 2 *-Einstrom? Zusammenfassung der bisherigen Ergebnisse Nachweis von TRP-Kanälen in PC12-Zellen mittels RT-PCR Nachweis von TRPC1 und C6 mittels Western-Blot Nachweis von TRPC1 und C6 mit Konfokaler Mikroskopie Transiente Transfektion von HEK-293-Zellen mit TRPC6 Plasmid Nachweis der Transfektion mittels Western-Blot 133
7 Effekte der Transfektion auf den Hyperforin induzierten Ca 2 * Influx im Vergleich zu nicht transferierten HEKZellen Langzeiteffekte von Hyperforin auf PC12-Zellen DISKUSSION Die Na*-Abhängigkeit der Monoamintransporter Der Serotonin-Transporter Weitere intrazelluläre Funktionen von Na* Zelluläre Funktion von Ca a * Regulation der [Na*], In neuronalen Zellen Na*/H T -Exchanger Der Na + /Ca 2 *-Exchanger Spannungsabhängige Na*-Kanäle NSCCs/TRP-Kanäle Regulation der [Ca 2t ], in neuronalen Zellen 1«5-5.1 NSCCsfTRP-Kanäle DieSOCCs DieVOCCs Mechanisch aktivierte Ca 2t Kanäle Die Ausschüttung von intrazellulärem Ca 2 * Die Bedeutung des ERs Die Rolle der Mitochondrien Bedeutung der TRP-Kanäle für die Hyperion«induzierte Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmung an humanen Thrombozyten Aktiviert Hyperforin über eine Signaltransduktions-Kaskade TRP- Kanäle oder interagiert es direkt mit den Kanälen? Beteiligung von TrKan dem Hyperforin vermittelten Kationen-Influx Bedeutung der Src-Kinasen für den Hyperforin induzierten Kationeninflux ^
8 Involvierung der PLC in den Hyperforin vermittelten Kationen-Influx Bedeutung von DAG für den Hyperforin induzierten Kationen influx Bedeutung der PKC für den Hyperforin induzierten Kationen influx Aktiviert Hyperforin wirklich TRPC6? ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS PUBLIKATIONEN CURR1CULUM VITAE DANKSAGUNG 210
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