Proteinbiochemischer Nachweis der Exprimierung von Myosin und Myosin-Light-Chain-Kinase in Trabekelwerkszellen des Auges
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- Ingelore Böhme
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1 Charité Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin Aus dem Institut für Klinische Physiologie Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Michael Fromm Proteinbiochemischer Nachweis der Exprimierung von Myosin und Myosin-Light-Chain-Kinase in Trabekelwerkszellen des Auges Inaugural Dissertation zur Erlangung der Medizinischen Doktorwürde der Charité Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin Sebastian Schlott Kassel 2003
2 - II - Referent: Prof. Dr. med. Michael Wiederholt Korreferent: Prof. Dr. med. Hans Georg Baumgarten Gedruckt mit Genehmigung der Charité Universitätsmedizin Berlin Campus Benjamin Franklin Promoviert am: 03. September 2004
3 - III - Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG Geschichte der Glaukomforschung Definition des Glaukoms Einteilung der Glaukomerkrankungen Epidemiologie des Glaukoms Histologischer Aufbau des Kammerwinkels Physiologie des Kammerwassers Befunde beim Primären Offenwinkelglaukom (POWG) Bedeutung des erhöhten Augeninnendruckes beim POWG Pathophysiologie des erhöhten Augeninnendruckes Senkung des Augeninnendruckes als Therapie beim POWG Bedeutung des Trabekelwerks in der Glaukomtherapie Ziel der Arbeit 7 2 MATERIAL UND METHODEN Molekularbiologische Untersuchungen Zellmaterialien Gewebepräparation Präparation humanen Gewebes Präparation bovinen Gewebes Zellkultivierung Zellstimulation Zelllysierung Lysierung kultivierter Zellen Lysierung nativer Gewebe Proteinquantifizierung Immunopräzipitation (IP) Gelelektrophorese 13
4 - IV Western-Blotting Immunologische Proteinmarkierung Membranstripping Kopräzipitation Auswertung Verwendete Lösungen Bezugsquellen von Chemiekalien und Antikörpern Funktionelle Untersuchungen: Kontraktilität Herkunft und Präparation der Gewebsmaterialien Messvorrichtung Kraft-Längen-Messer Perfusionssystem Durchführung der Messung Statistische Auswertung und Darstellung der Messdaten Auswertung Verwendete Lösungen Verwendete Pharmaka 25 3 ERGEBNISSE Ergebnisse molekularbiologischer Experimente Gewebsuntersuchungen zum Nachweis von glattmuskulärem Myosin Kultiviertes humanes Trabekelwerk (k-htm) Kultiviertes bovines Trabekelwerk (k-btm) Natives bovines Trabekelwerk (n-btm) Gewebsuntersuchungen zum Nachweis von Myosin-Light-Chain- Kinase Kultiviertes humanes Trabekelwerk Natives humanes Trabekelwerk (n-htm) Kultiviertes bovines Trabekelwerk Natives bovines Trabekelwerk Nativer boviner Ziliarmuskel (n-bzm) Kopräzipitation von Myosin-Light-Chain-Kinase und Myosin Experimente mit kultiviertem humanen Trabekelwerk Experimente mit nativem bovinen Trabekelwerk 35
5 - V Nachweis von Phosphoserinen der Myosin-Light-Chain-Kinase Kultiviertes humanes Trabekelwerk Natives humanes Trabekelwerk Natives bovines Trabekelwerk Versuche zum Nachweis von ROCK 1 / 2 in humanem Trabekelwerk Ergebnisse der Kontraktionsexperimente Kontraktionshemmung von TM und ZM durch MLCK-Inhibitor ML Hemmung ET 1 -induzierter Kontraktionen in TM durch ML DISKUSSION Arbeitshypothese Kontraktionsregulation in glatter Muskulatur Kalziumunabhängiger Kontraktionsmechanismen im Trabekelwerk Übersicht verschiedener Regulationsmechanismen der Kontraktion Kontraktionsregulation durch Ca 2+ -Sensitivierung Signaltransduktion über Rho-A Signaltransduktion über die Proteinkinase C (PKC) Das glattmuskuläre Kontraktionssystem des Trabekelwerks Bisherige Befunde zur Unterstützung der Hypothese glattmuskelartiger Kontraktionssysteme in TM Andere Ansätze zur Erklärung der Rolle des Trabekelwerks für den Kammerwasserabfluss Veränderung von Zytoskelettstrukturen des Trabekelwerks Die Rolle des Myocilin/TIGR-Protein bei der Regulation des Kammerwasserabflusses Unterstützung der Hypothese glattmuskelartiger Kontraktionssysteme im Trabekelwerk durch neue Forschungsergebnisse dieser Arbeit Das Glattmuskelmyosin Molekularbiologischer Myosin-Nachweis im Trabekelwerk Die Myosin-Light-Chain-Kinase (MLCK) Molekularbiologischer Nachweis von MLCK im Trabekelwerk Gebundenes Vorliegen von Myosin und Myosin-Light-Chain-Kinase 56
6 - VI Molekularbiologischer Nachweis des gebundenen Vorliegens von Myosin und MLCK im Trabekelwerk Phosphoserine der Myosin-Light-Chain-Kinase Molekularbiologischer Nachweis von Phosphoserinen der MLCK in Trabekelwerk Die Bedeutung von Endothelin am Trabekelwerk Hemmung ET 1 - und Cabachol-induzierter Kontraktion durch MLCK-Inhibitor ML-7 im TM Kontraktionsregulation durch Ca 2+ -Sensitivierung im Trabekelwerk Die Proteinkinase C (PKC) Das Rho-A-Protein Die Rho-Kinase (ROCK) Inhibition der ROCK Versuch des molekularbiologischen Nachweises der ROCK im Trabekelwerk Die Myosin-Light-Chain-Phosphatase (MLCP) Myosin-Light-Chain-Kinase als Gegenspieler der MLCP Proteinnachweise in bovinem TM zur Bestätigung der Aussagen verschiedener Kontraktionsexperimente Inhibitionsmöglichkeiten der durch Ca 2+ -Sensitivierung geregelten TM- Kontraktion zur Therapie des Glaukoms Zukünftige Experimente 69 5 ZUSAMMENFASSUNG 71 6 LITERATURVERZEICHNIS 73 7 ANHANG Abkürzungsverzeichnis Danksagung Veröffentlichung von Teilen der Arbeit Lebenslauf 85
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DISSERTATION. Diagnosespektrum in homöopathischen Arztpraxen eine prospektive Beobachtungsstudie und ein Vergleich zu konventionellen Arztpraxen
Aus dem Institut für Sozialmedizin, Epidemiologie und Gesundheitsökonomie der Medizinischen Fakultät Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Diagnosespektrum in homöopathischen Arztpraxen eine
HOCHFREQUENZSTROMINDUZIERTE THERMOTHERAPIE MALIGNER LEBERTUMOREN APPLIKATORERPROBUNG AN DER GESUNDEN SCHWEINELEBER
Aus den Abteilungen für Allgemein-, Gefäß- und Thoraxchirurgie im Universitätsklinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin und Medizinische/Technische Physik und Lasermedizin im Universitätsklinikum
DISSERTATION. zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.)
Aus der Abteilung für Experimentelle Zahnheilkunde der Klinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde der Medizinischen Fakultät der Charité Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Experimentelle Untersuchungen