Characterization o f glioblastoma stem cells upon. triggering o f CD95
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- Lars Schmidt
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1 Aus dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg Direktor (kommissarisch): Prof. Dr. rer. nat. Michael Boutros Abteilung für Molekulare Neurobiologie Abteilungsleiterin Prof. Dr. med. Ana Martin-Villalba Characterization o f glioblastoma stem cells upon triggering o f CD95 Inauguraldissertation zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät Heidelberg der Ruprecht-Karls-Universität vorgelegt von Andreas Kuhn aus Heilbronn 2015 Tag der mündlichen Prüfung: 1 0. MOV. 2016
2 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS... I ABBILDUNGSVERZEICHNIS...V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...VII 1. EINLEITUNG Tumore des zentralen Nervensystems Das Glioblastoma multiforme Stammzellen Eigenschaften von Glioblastomstammzellen Das CD95/CD95L-System Die strukturellen Eigenschaften von CD95 und CD95L CD95/CD95L im ZN S CD95 und die Tumorzellen Die Blut-Hirn-Schranke und der hochintensive fokussierte Ultraschall (HIFU) Der Wirkmechanismus von HIFU Zielsetzung der Promotionsarbeit MATERIALIEN UND METHODEN Materialien Zelllinien Mausstämme Chemikalien und Reagenzien Puffer und Lösungen Antikörper Kits Ausstattung und Geräte... 17
3 2.2. Methoden Kultivierung eukaryotischer Zellen Isolierung und Kultivierung von humanen Glioblastomstammzellen (GSZ) Antikörperfarbung für das Durchflusszytometer (Fluorescence activated cell sorter F A C S ) Tumorsphären-Assay Nachweisverfahren zur Apoptosemessung (Nicoletti-Protokoll) Spheroidkulturen Kollagen-Invasions-Assay RNA-Isolierung mit dem Qiagen M ini-kit Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Real-Time-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) In vzvo-experimente Histologische Aufarbeitungen der Mäusehime zu Paraffmschnitten Färbung gegen Ki67 und N estin Reversible Öffnung der BHS mit HIFU und dem Ultraschallkontrastmittel SonoVue ERGEBNISSE GBM-Stammzelllinien in Kultur Die Expression von CD95, CD95L und CD 133 in der NCH547-GBM- Stammzellkultur Anteil CD95-positiver Zellen nimmt in Kultur ab Im Tumorsphären-Assay unterscheiden sich GBM-Stammzellkulturen in ihrem Verhalten von Nicht-GBM-Stammzellkulturen NCH547-GBM-Stammzellkultur resistent gegenüber CD95- und TRAIL- Rezeptor-induzierter Apoptose Migrationsverhalten von NCH547-Spheroidkulturen im Kollagen-Invasions- Assay Real-time-PCR für Matrix-Metalloproteinasen in NCH
4 3.8. Glioblastomstammzellen in vivo NCH547-GSZ initiieren Tumorwachstum in SCID/bg-Mäusen Reinjektion von Tumorzellen aus GBM-Stammzellkulturen halbiert die Zeit bis zur Tumorformation Reinjektion von Tumorzellen aus GBM-Stammzellkulturen reichert Zellen mit Stammzellmarker an und erhöht den Proliferationsindex CD95-Expression lässt sich bei serieller Tumortransplantation auf hohem Niveau stabilisieren Nachweis von Tumorzellen in der kontralateralen Hemisphäre Die Blockade des murinen CD95L in vivo Die Blockade des humanen CD95L reduziert die Migration von SMA-Zellen in vivo Mit hochintensiv fokussiertem Ultraschall (HIFU) gelingt eine reversible Öffnung der Bluthimschranke (BHS) für mehr als 24 Stunden Therapie mit HIFU und dem CD95-Fc-Protein verlangsamt das Tumorwachstum und reduziert die Migration von SMA-Zellen in vivo DISKUSSION Wirkungen und Nebenwirkungen des CD95/CD95L-Systems Die Etablierung von Glioblastomstammzellkulturen Alte, neue und potentielle Glioblastomstammzellmarker Der Tumorsphären-Assay als funktioneller Assay zur Etablierung von Glioblastomstammzellkulturen Die Stimulation von CD95 steigert in vitro die Migration in Glioblastomstammzellkulturen Glioblastomstammzellkulturen im xenogenen Mausmodell CD95, CD95L und MHC I im xenogenen Mausmodell HIFU-Therapie und das CD95-Fc-Protein im Mausmodell Das Potential einer Therapie basierend auf dem CD95-Fc-Protein... 65
5 5. ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN LEBENSLAUF DANKSAGUNG...100
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Institute for Immunology and Thymus Research Laboratory for Autologous Adult Stem Cell Research and Therapy Rudolf-Huch-Str. 14 D- 38667 Bad Harzburg Tel: +49 (0)5322 96 05 14 Fax: +49 (0)5322 96 05 16
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Chimäre χίμαιρα Ziege Lykisches Ungeheuer: πρόσθε λέων, ǒπισθεν θέ δράκων, μέσση θέ χίμαιρα Vorn ein Löwe, hinten eine Schlange, in der Mitte eine Ziege Sphinx: Löwe mit Frauenkopf Definition Eine Chimäre