The Role of Antibody-Dependent Cellular Effector Functions in CNS Tumour Immunotherapy

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1 DISS. ETH No The Role of Antibody-Dependent Cellular Effector Functions in CNS Tumour Immunotherapy A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH For the degree of Doctor of Sciences presented by URSULA PÜNTENER Dipl. Natw. ETH born July 8 th, 1977 citizen of Pfäffikon/ZH Examiners: Prof. M. Kopf, examiner Prof. A. Oxenius, co-examiner Prof. A. Fontana, co-examiner Dr. P. Umaña, co-examiner 2008

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3 1. Summary Even though malignant gliomas are relatively rare, they remain among the most treatment refractory types of tumour due to their localization in the central nervous system (CNS), which often prevents complete surgical removal of the tumour tissue. Furthermore, the immune privilege of the CNS impedes effective anti-tumour response and treatment success remains dismal. It has been reported by many independent groups that microglia/macrophages infiltrate human glioma in abundant numbers. This led to the suggestion that these tumour infiltrating microglia/macrophages could be used to mount a cytotoxic immune effector response against the glioma cells. This work focuses on an antibody therapy approach against gliomas, enabling the brain resident microglia to exert antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) towards glioma cells. The analysis of Fcγ receptor (FcγR) expression on human microglia originating from human primary brain tumours revealed, that microglia indeed express all FcγRs when freshly isolated from tumour tissue. Furthermore, the study shows for the first time that murine microglia also express all four types of FcγRs, including the recently discovered FcγRIV. Additionally, it was shown that murine and human astrocytes do not express FcγRs. In vitro assays performed with murine and human microglia showed that microglia are able to kill human glioma target cells by ADCC using a specific monoclonal antibody directed at the human epidermal growth factor receptor (EGFR) on glioma cells. Two cytotoxicity mechanisms were observed in the in vitro assays with murine neonatal microglia against human glioma cells: i) an antibody-independent part of killing and ii) an antibody-dependent part of killing. The antibody-dependent cytotoxicity of microglia was FcγR-dependent and bound to the antibody specificity, which was demonstrated by the use of Fcγ chain deficient (Fcγ -/- ) microglia and an irrelevant antibody or an EGFR - cell line in the ADCC assay, respectively. The analysis of potential cytotoxic molecules showed that TNFα is the main effector molecule and that the antibody-dependent cytotoxicity is independent of complement, nitric oxide (NO), Fas ligand and reactive oxygen species (ROS). The antibody-independent part of microglia cytotoxicity on the other hand seems to be partly mediated by ROS and is not mediated by TNFα, which was demonstrated using TNFα -/- microglia. ADCC assays performed in the presence of FcγR-blocking antibodies demonstrated that FcγRI is the main activating receptor for microglial ADCC induction, while blocking of 1

4 the inhibitory FcγRII/III resulted in enhanced killing of the target cells, and FcγRIV appears not to be involved in microglial ADCC. The in vivo experiments performed in C57BL/6 and Fcγ -/- mice confirmed the in vitro obtained result that the antibody-dependent cytotoxic function of microglia was dependent on the activating FcγRs. Intracerebral tumour volume of mice treated with the specific anti-human EGFR antibody versus an isotype control antibody were reduced in size only in mice that carried all activating receptors. This functional failure of the Fcγ -/- mice to induce an antibody-dependent anti-tumour response opened the possibility to investigate on the origin of the microglia/macrophage type effector cells found in tumours in abundant numbers. Experiments with reciprocal bone marrow chimeras of C57BL/6 and Fcγ -/- mice indicated that the antibody-dependent diminishment of the experimental brain tumour growth was most likely mediated by microglia and not peripheral, infiltrating macrophages. Further evidence for this phenomenon was given by the fact that bone marrow derived macrophages produced less TNFα than microglia upon FcγR cross-linking. Moreover, microglia seemed to be less sensitive to TGFβmediated down-regulation of FcγRI than bone marrow derived macrophages, and the addition of TGFβ to the in vitro ADCC assay did not alter the antibody-dependent cytotoxic potential of microglia, whereas the macrophage ADCC was slightly reduced upon addition of the immunosuppressive cytokine. These findings indicate that antibody-dependent effector functions in the brain are indeed mediated by the brain resident microglia by cross-linking of FcγRI and subsequent production of TNFα, which leads to glioma cell killing. This mechanism is different from the peripheral ADCC, which is mediated mainly via human FcγRIIIa on human natural killer cells (NKs) or by murine FcγRIV on murine macrophages. This new insight in FcγR biology of the brain will help for the design of anti-glioma antibodies specially aimed to function in the brain. 2

5 1. Zusammenfassung Obwohl Gliome relativ selten sind, gehören sie zu den am schwierigsten zu behandelnden Tumoren. Dies hängt mit ihrer Lokalisation im zentralen Nervensystem (ZNS) zusammen, welche häufig eine vollständige chirurgische Entfernung des Tumorgewebes verhindert. Das immunologisch privilegierte ZNS verhindert ausserdem eine effektive anti-tumor Antwort, was die Behandlungserfolge susätzlich verringert. Es wurde von verschiedenen unabhängigen Gruppen berichtet, dass Gliome stark durch Mikroglia/Makrophagen infiltriert werden. Dies führte zu der Überlegung, dass die infiltrierenden Mikroglia/Makrophagen genutzt werden könnten, um eine zytotoxische, zelluläre Immun-Effektor Antwort gegen Gliome aufzubauen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung eines Antikörper-basierten Therapieansatzes zur Behandlung von Gliomen, bei dem die im Hirn ansässigen Mikroglia befähigt werden sollten, eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) auf Gliome auszuüben. Die Untersuchung der Fcγ-Rezeptor (FcγR)-Expression auf humanen Mikroglia, welche von humanen primären Hirntumoren isoliert wurden, zeigte, dass Mikroglia im Tumorgewebe in der Tat alle FcγR exprimieren. Dies gilt auch für murine Mikroglia, bei welchen erstmals auch der kürzlich beschriebene FcγRIV nachgewiesen wurde. Zudem wurde gezeigt, dass murine und humane Astrozyten keine FcγRs exprimieren. Durch in vitro Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass murine und humane Mikroglia humane Gliom-Zielzellen durch ADCC abtöten können. Der dabei eingesetzte Antikörper war spezifisch für den humanen Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) auf Gliomzellen. Es wurden dabei zwei Zytotoxizitätsmechanismen gefunden: i) ein Antikörper abhängiger Anteil des Zelltodes und ii) ein Antikörper unabhängiger Anteil des Zelltodes. Die Antikörper abhängige Zytotoxizität von Mikroglia war FcγRabhängig und an die Spezifität des Antikörpers gebunden, was durch die Verwendung von Fcγ -/- Mikroglia und einem irrelevanten Antikörper oder einer EGFR - Zelllinie im ADCC Experiment gezeigt werden konnte. Die Analyse von potenziell zytotoxischen Molekülen zeigte, dass TNFα das Haupteffektor-Molekül ist und dass der Mikroglia ADCC unabhängig von Komplement Komponenten, Stickstoffmonoxid (NO), Fas Ligand und reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS) ist. Der Antikörper unabhängige Teil der Mikroglia Zytotoxizität scheint hingegen nicht durch TNFα, sondern zum Teil durch ROS vermittelt zu werden, was mittels TNFα -/- Mikroglia gezeigt werden konnte. 3

6 ADCC Experimente in Anwesenheit von FcγR-blockierenden Antikörpern zeigten, dass hauptsächlich FcγRI für die Auslösung des ADCC verantwortlich ist, während die Blockierung von FcγRII/III mit einer erhöhten Zytotoxizität einher ging. FcγRIV scheint nicht in Mikroglia ADCC involviert zu sein. In vivo Experimente mit C57BL/6 und Fcγ -/- Mäusen bestätigten die in vitro gefundenen Resultate, dass die ADCC-Funktion von Mikroglia von den aktivierenden FcγRs abhängig ist. Das Volumen von intracerebralen Tumoren, welche mit anti-humanen EGFR Antikörpern behandelt wurden, verringerte sich nur in Mäusen, welche alle aktivierenden Rezeptoren besassen. Die funktionelle Unfähigkeit von Fcγ -/- Mäusen eine ADCC Antwort auszulösen, eröffnete die Möglichkeit, den Ursprung der Mikroglia/Makrophagen-artigen Effektorzellen in Hirntumorgewebe zu untersuchen. Experimente mit reziproken Knochenmark-Chimären von C57BL/6 und Fcγ -/- Mäusen deuten an, dass die Antikörper-abhängige Verringerung des Wachstums von experimentellen Tumoren durch Mikroglia und nicht durch periphere, einwandernde Makrophagen vermittelt wird. Ein weiterer Hinweis dazu liefert die Tatsache, dass Makrophagen weniger TNFα als Antwort auf FcγR Kreuzvernetzung produzieren als Mikroglia. Zudem scheinen Mikroglia nach Stimulation durch TGFβ die FcγRI Expression weniger stark herunter zu regulieren als Knochenmark-Makrophagen. Die Zugabe des immun-suppressiven Zytokins TGFβ zum ADCC Experiment veränderte die Zytotoxizität von Mikroglia gegenüber Tumorzellen nicht, wogegen die Zytotoxizität von Makrophagen vermindert wurde. Diese Resultate zeigen, dass Antikörper vermittelte Effektorfunktionen im Hirn tatsächlich von den im Hirn ansässigen Mikroglia durch FcγRI Kreuzvernetzung und der daraus resultierenden TNFα Sekretion vermittelt wird. Dieser Mechanismus unterscheidet sich von peripherem ADCC, der beim Menschen durch natürliche Killerzellen mittels FcγRIIIa und in der Maus durch periphere Makrophagen mittels FcγRIV vermittelt wird. Dieser neue Einblick in die FcγR Biologie des Hirns könnte dazu beitragen, neuartige Antikörper zur Behandlung von Tumoren im Hirn zu entwickeln. 4