LIFE SCIENCES Forschung & Entwicklung

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1 LIFE SCIENCES Forschung & Entwicklung Vol. 9 RHOMBOS

2 Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar Umschlag: Rhombos-Verlag, Berlin, Titelbild: Sébastien Peter RHOMBOS-VERLAG Fachverlag für Forschung, Wissenschaft und Politik Kurfürstenstr. 15/16 D Berlin Internet: Verkehrsnummer: RHOMBOS-VERLAG, Berlin Alle Rechte vorbehalten. Nachdruck, auch auszugsweise, verboten. Kein Teil dieses Werkes darf außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ohne schriftliche Einwilligung des Verlages in irgendeiner Form (Fotokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren) reproduziert oder unter Verwendung elektronischer Systeme gespeichert, verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürfen. Druck: PRINT GROUP Sp. z o.o. Printed in Poland ISBN

3 Spectro Microscopy of Autofluorescent Biomolecules Dissertation der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Sébastien Peter aus Rorschach/Schweiz Tübingen 2014

4 Tag der mündlichen Qualifikation: Dekan: Prof. Dr. Wolfgang Rosenstiel 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Alfred J. Meixner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Klaus Harter 3. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Huser

5 Table of Contents 1 Introduction and outline of this work Introduction Outline Theoretical background Optical spectroscopy Single molecule spectroscopy and confocal microscopy Structure of plant cells Autofluorescent proteins Materials and methods Confocal microscopy Molecular biology Software and protein structures Photophysical characterization of the redox sensitive green fluorescent protein rogfp2 by ensemble and single molecule spectroscopy Introduction Materials and methods Ensemble parameters Single molecule spectroscopy Discussion Concluding remarks Novel chimeric autofluorescent proteins as model system for multicolor Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Introduction Background information: Sequences of the parent proteins and influences by single mutations Materials and methods Spectral characterization of the generated BiFC chimeras Chemical characterization: acidity of the chromophore Determination of ensemble photophysical parameters Single molecule emission spectroscopy and spectral distribution width Discussion Concluding remarks III

6 6 In vivo validation of putative protein-protein interaction by FRET FLIM: a case study Introduction Background of this study Materials and methods Results Discussion Concluding remarks Room temperature excitation spectroscopy of single quantum dots Introduction Materials and methods Single emitter characteristics Excitation spectra of single semiconductor nanocrystals Discussion Concluding remarks Photosynthesis in a different light: Spectro microscopy for in vivo characterization of chloroplasts Introduction Materials and methods Results Discussion Concluding remarks Towards spectro nanoscopy: a perspective Introduction Materials and methods Evaluation of the saturation intensity I sat Implementation of fluorescence lifetime spectroscopy in nanoscopy Discussion Concluding remarks Summary 137 References 141 IV

7 A Scientific contributions 159 B Academic Teachers 163 C German Summary 165 D Curriculum vitae 169 E Acknowledgement 171 V