Entwicklung und Optimierung von in vitro Testverfahren zur Evaluierung von antiinflammatorisch wirkenden Arzneistoffen

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1 Entwicklung und Optimierung von in vitro Testverfahren zur Evaluierung von antiinflammatorisch wirkenden Arzneistoffen DISSERTATION der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2002 vorgelegt von CORNELIA GREIM

2 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung Zytokine lnterleukin Tumornekrosefaktor Derp38-MAP Kinase Signaltransduktionsweg Metaboliten der Arachidonsäurekaskade Arachidonsäurekaskade Der Cyclooxygenaseabbauweg Der 5-Lipoxygenaseabbauweg 26 2 Zielsetzung 30 3 Untersuchung und Optimierung des in vitro Testverfahrens zur Evaluierung von Hemmstoffen der Biosynthese proinflammatorischer Zytokine Einführung, Nachweis der Aktivierung des p38-map Kinase Signaltransduktionswegs in LPS stimulierten PBMCs Nachweis der Neubildung von IL-1ß und TNFcc spezifischer mrna nach Stimulation der Zellen mittels LPS Nachweis der Aktivierung von p38-map Kinase in LPS stimulierten PBMCs 3.3 Vorbereitung des Testverfahrens auf die Durchführung mittels eines Pipettierroboters Einführung Reduzierung der Pipettierschritte und Verringerung der Pipettiervolumina r Durchführung des Testverfahrens in einer 96 Deep Well-Platte Verwendung von ELISAs alternativer Hersteller Untersuchung der Wirkungsweise der Testverbindungen KO 346, KO 353 und RW Einführung 55 I VI 42

3 3.4.2 Quantifizierung von pro-il-1ß und IL-1ß Bestimmung der Beeinflussung der ICE-Aktivität durch KO 346, KO 353 und RW64 mittels isoliertem rekombinantem Enzym Bestimmung der Beeinflussung der ICE-Aktivität durch KO 346, KO 353 und RW 64 im Zelllysat von LPS stimulierten PBMCs 64 4 Zelltoxizitätassay Einführung Laktatdehydrogenaseassay Festlegung der optimalen Zellzahl Festlegung der optimalen Inkubationszeit Untersuchung des Einflusses verschiedener Lösungsmittel und Lösungsvermittler auf den Laktatdehydrogenaseassay Untersuchung der Wechselwirkung der zu untersuchenden Testsubstanzen mit dem Enzym Laktatdehydrogenase Untersuchung der Zelltoxizität verschiedener Hemmstoffe und Diskussion der Ergebnisse MTT-Zelltoxizitätsassay Festlegung der optimalen Zellzahl und Inkubationszeiten Untersuchung des Einflusses von Lösungsmitteln und Lösungsvermittlern auf den MTT-Assay Untersuchung der Zelltoxizität verschiedener Hemmstoffe Vergleich verschiedener Möglichkeiten zur Bestimmung der Zelltoxizität - Vergleich von Laktatdehydrogenaseassay, MTT-Assay und Trypanblaufärbung 87 5 In vitro Testverfahren zur Evaluierung von COX-1 und 5-LO Hemmstoffen in humanem Vollblut Einführung COX-1 in vitro Testverfahren in humanem Vollblut Lösungsmittel PGE2-Freisetzungskinetik über 30 min nach Stimulation mit CalciumionophorA Untersuchung des Einflusses von CaCb-Lösung auf die PGE2- Freisetzung und Vergleich unterschiedlicher Calciumionophorkonzentrationen 99

4 IM Untersuchung des Einflusses von NDGA auf die Menge an quantifizierbarem PGE Validierung des COX-1 Vollbluttestverfahrens LO in vitro Testverfahren in humanem Vollblut LTB 4 -Freisetzungskinetik über 30 min nach Stimulation mit CalciumionophorA Untersuchung des Einflusses von CaCIrLösung auf die LTB 4 - Freisetzung und Vergleich unterschiedlicher Calciumionophorkonzentrationen Untersuchung des Einflusses von NDGA auf die Menge an quantifizierbarem LTB Validierung des*5-lo Vollbluttestverfahrens mit Calciumionophorstimulation LTB 4 -Freisetzungskinetik über 24 h nach Stimulation mit LPS LTB 4 -Freisetzungskinetik über 30 min nach Stimulation mitfmlp LTB 4 -Freisetzung nach Vorstimulation des Vollbluts mit LPS und anschließender Stimulation mitfmlp Validierung des 5-LO Vollbluttestverfahrens mit LPS-Vorbehandlung und fmlp-stimulation Zusammenfassung Geräte, Chemikalien und Reagenzien Geräte Chemikalien Reagenzien In vitro Standardtestverfahren zur Evaluierung Hemmstoffen IL-1ß und TNFoc-Biosynthese mrna Quantifzierung p38-map Kinase Assay Bestimmung der Kinase-Aktivität'im Zelllysat Western Blot Analyse Vorbereitung auf die Bearbeitung mit einem Pipettierroboter Laktatdehydrogenaseassay MTT-Assay Bestimmung von pro-il-1ß 153

5 IV Bestimmung der ICE-Aktivität COX-1 und 5-LO Assay im Vollblut COX-1 und 5-LO Assay in isolierten Thrombozyten bzw. Granulozyten Formeln zur statistischen Auswertung der Versuche Versuchsbezogene Vorschriften Standardversuchmethoden Standardversuchsmethode in vitro Testverfahren zur Evaluierung von Hemmstoffen der IL-1ß- und TNFa-Biosynthese in isolierten mononukleären Zellen (PBMCs) Standardvefsuchsmethode in vitro Testverfahren zur Evaluierung von p38- MAP Kinase Hemmstoffen Vorbereitung auf die Bearbeitung mit einem Pipettierroboter Standardversuchsmethode zur Bestimmung der Zelltoxizität durch Messung der Laktatdehydrogenaseaktivität Standardversuchsmethode zur Bestimmung der Zelltoxizität durch Bestimmung der mitochondrialen Aktivität Standardversuchsmethode zur Bestimmung von pro-il-1 ß in PBMCs Standardversuchsmethode in vitro Testverfahren zur Evaluierung von COX-1- und 5-LO-Hemstoffen in humanem Vollblut Standardversuchsmethode in vitro Testverfahren zur Evaluierung von COX-1- und 5-LO-Hemmstoffen in isolierten Thrombozyten bzw. Granulozyten Spezielle Versuchsmethoden Quantifizierung von IL-1ß und TNFa spezifischer mrna Bestimmung der Kinaseaktivität im Zelllysat Nachweis der p38-map Kinase Phosphorylierung mittels Western Blot Analyse.' Vorbereitung für die Bearbeitung mit einem Pipettierroboter Festlegung der Versuchsparameter für die Bestimmung der Zelltoxizität mittels Laktatdehydrogenaseassay (LDH-Assay) Festlegung der Versuchsparameter für die Bestimmung der Zelltoxizität durch Messung der mitochondrialen Aktivität (MTT-Assay) 196

6 8.2.7 Bestimmung von pro-il-1ß in PBMCs Bestimmung der Beeinflussung der ICE-Aktivität durch KO 346, KO 353 und RW64 mittels rekombinanter ICE (Caspase-1) Bestimmung der Beeinflussung der ICE-Aktivität im Zelllysat durch KO 346, KO353undRW Festlegung der Versuchsparameter für den 5-LO Vollblutassay Festlegung der Versuchsparameter für den COX-1 Vollblutassay Literaturverzeichnis 210