Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Differenzierung von Funktionen und Strukturen bakterieller Populationen des Bodens

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1 6 Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Differenzierung von Funktionen und Strukturen bakterieller Populationen des Bodens Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Bert Engelen Duisburg

2 1. EINLEITUNG Grundlagen der mikrobiellen Ökologie Molekularbiologische Methoden in der Bakteriensystematik Die Bedeutung und Organisation der ribosomalen RNA in der Zelle Die Eignung der ribosomalen RNA für phylogenetische Analysen Phylogenetische Charakterisierung von Bakterien Anwendung molekularbiologischer Methoden zur strukturellen Analyse von Bakteriengemeinschaften Die Erfassung genetischer Fingerabdrücke bakterieller Gemeinschaften Anwendung des BIOLOG-Systems zur funktionellen Analyse von Bakteriengemeinschaften Die Untersuchung von anthropogenen Effekten auf Bodenmikroorganismen Aufgabenstellung und Gliederung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Laborbedarf Chemikalien, Enzyme, Nukleinsäuren und Reagenziensysteme Geräte Kulturmedien Sterilisationstechniken Probenahmen Mikroorganismen, Verwendete Bakterienstämme Zellextraktion aus Bodenproben Bestimmung der Bakterien-Konzentration Extraktion von Nukleinsäuren Extraktion chromosomaler DNA aus Bakterienzellen Direkt-Extraktion von DNA aus Bodenproben Extraktion von Ribosomen aus Bodenproben zur Gewinnung von rrna Plasmid-Extraktion aus Escherichia coli 27

3 Reinigung der extrahierten Nukleinsäuren Aufreinigung genomischer DNA durch Fällungsreaktionen Reinigung genomischer DNA über Wizard -Säulen Reinigung von genomischer DNA über Glasmilch Aufreinigung ribosomaler RNA Konzentrationsbestimmungen Bestimmung der DNA-Konzentration von Gelbanden Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration Die Polymerase-Kettenreaktion PCR-Primer PCR zur Amplifikation von Abschnitten der 16S-rDNA RT-PCR zur Amplifikation von Abschnitten der 16S-rRNA Reinigung von PCR-Produkten TA-Klonierung von PCR-Produkten Ligation Präparation von transformationskompetenten Zellen Transformation Sequenzierung klonierter PCR-Produkte Elektrophorese-Techniken Agarosegelelektrophorese Temperatur Gradienten Gel Elektrophorese (TGGE) Gelpräparation und Elektrophorese Silberfärbung von TGGE-Gelen Extraktion von TGGE-Banden BIOLOG Untersuchungen Aufbau der BIOLOG-Platten Beimpfung und Inkubation der BIOLOG-Platten Rohdatenbehandlung Statistische Analyse von BIOLOG-Daten Die Hauptkomponenten-Analyse Der PC-Test Identifizierung von wichtigen Kohlenstoffquellen Angewendete Methoden in einem Laborversuch Eingesetzte Pflanzenschutzmittel Typ und Aufbereitung des Versuchsbodens Experimenteller Ansatz Substrat-induzierte Kurzzeitatmung Dehydrogenaseaktivität Mineralischer Stickstoffgehalt Langzeitatmung 54

4 3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE Entwicklung der verwendeten PCR-Primer Prüfung der verwendeten PCR-Primer Kompatibilität der Primer Mögliches Fehl-Priming Unvollständige GC-Klammern durch Ausbildung von Sekundärstrukturen Unvollständige GC-Klammern durch fehlerhafte Primersynthese Anpassung und Optimierung der TGGE-Bedingungen Theoretische Berechnung des Laufverhaltens der untersuchten PCR-Produkte Optimierung des Laufverhaltens von PCR-Produkten in der TGGE Erste Erfassung genetischer Fingerabdrücke bakterieller Gemeinschaften Vergleich der 16S-rDNA/RNA-Profile bakterieller Gemeinschaften Untersuchung zur präferentiellen Amplifikation von PCR-Produkten Untersuchung von Faktoren, die BIOLOG-Analysen beeinflussen Untersuchungen an Bakterien-Reinkulturen Überprüfung des Einflusses einer Vorkultivierung auf die Musterentwicklung Untersuchungen zum Einfluß verschiedener Animpfdichten auf Substratverwertungskinetiken Untersuchungen an natürlichen Bakteriengemeinschaften Substratverwertungskinetiken verschiedener Bakterienpopulationen Untersuchungen zum Einfluß verschiedener Animpfdichten Normierung von Rohdaten durch AWCD-Korrektur Vergleich der Heterogenitäten von Einzel- und Sammelproben Analyse der Bakterienpopulationen des Feldversuches über das BIOLOG- System und die TGGE Erfassung der wichtigsten Kohlenstoff quellen für die Differenzierung Untersuchung der unterschiedlichen Bakteriengemeinschaften über die gesamte Beobachtungszeit BIOLOG-Analyse TGGE-Analyse Untersuchung einer Pestizidein Wirkung auf Bakterienpopulationen in einem Laborversuch Ergebnisse der konventionell verwendeten Techniken Ergebnisse der BIOLOG-Analyse Ergebnisse der TGGE-Analyse 93

5 4. DISKUSSION Der Einfluß von Randbedingungen auf die TGGE- und die BIOLOG-Analyse Probenahme Extraktionsmethoden Zellextraktion aus Bodenproben DNA-Extraktion < Extraktion von Ribosomen zur Gewinnung von rrna Zellaufschluß Das resultierende Bandenmuster in der TGGE Grundsätzliche Fehlerquellen und Limitierungen der PCR/RT-PCR Quantitative Effekte Qualitative Effekte PCR-Primer Die Spezifität der PCR-Primer Die Stabilität der PCR-Primer (unvollständige GC-Klammern) Besonderheiten der Zielsequenzen Probleme bei der Extraktion und Reamplifikation von TGGE-Banden Die Inkubation von Bakteriensuspensionen in BIOLOG-Platten Diskussion der Ergebnisse des Feldversuches Diskussion der Ergebnisse des Laborversuches Die Eignung der TGGE für die strukturelle Analyse von Bakterienpopulationen Die Eignung des BIOLOG-Systems für die funktioneile Analyse von Bakterienpopulationen Abschließende Bewertung und Ausblick ZUSAMMENFASSUNG LITERATUR 125