PCR basierte- Detektionstechniken

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1 PCR basierte- Detektionstechniken

2 Warum überhaupt? Forensische Analysen: Vaterschaftstests, Kriminalistik Mikrobielle Gemeinschaften: Biofilme, medizinische Mikrobiologie 2

3 Warum überhaupt? minimale Mengen an DNA ausreichend zeitsparend, schneller Überblick Erfassung aller Bakterienpopulationen kulturunabhängig 3

4 PCR- Methode ( Strangtrennung durch kurzzeitiges Erhitzen der DNA auf 95 C Hybridisierung der Primer bei spezifischer Annealingtemperatur DNA-Synthese bei 72 C durch eine hitzeresistente DNA- Polymerase Kary B. Mullis Nobelpreis

5 Sequenzierung von PCR-Fragmenten nach Sanger Frederick Sanger Nobelpreis für Chemie

6 1. Humane Anwendungen Vaterschaftstests Forensische Analysen Ahnenforschung Analyse fossiler DNA 6

7 Fingerprinting bei Menschen Tandem-Repeat-Polymorphismen durch repetitive Cluster charakterisiert in nicht-kodierenden Bereichen der DNA (Introns, Pseudogene). co-dominante Vererbung Short Tandem Repeats (STR) Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) 7

8 Vaterschaftstest M Kindsmutter K Kind PV Putativvater 8

9 2. Mikrobiologische Anwendungen Identifizierung von Mikroorganismen in unterschiedlichen Habitaten Erregernachweis bei Infektionskrankheiten Phylogenetische Analysen 9

10 Phylogenetische Marker Ribosomale RNA (5S, 16S, 23S) Spezifische Gene (z.b. rpon) Phospholipide, Fettsäuren Internal Transcribed Spacer Regions (ITS) 10

11 16S rrna DNA Ribosom Protein Strukturelle und katalytische Komponente der Ribosomen Hohe Kopienzahl Ca Basenpaare 11

12 16S rrna Bakterielles 70S Ribosom 23S und 5S rrna 16S rrna E. coli :

13 16S rrna Mutationen oft letal Konstanter Selektionsdruck Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert Vergleich analoger variabler Bereiche Datenbanken 13

14 COM-Primer 14

15 Fingerprinting Bakteriengemeinschaften 15

16 Methoden Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) Amplified rdna Restriction Analysis (ARDRA) Terminal Restriktion-Fragment-Length-Polymorphismus (trflp) 16

17 SSCP Unterscheidung von DNA-Molekülen derselben Länge aber unterschiedlicher Sequenz Auftrennung nach Sekundärstruktur der einzelsträngigen PCR Produkte DNA - Konformation ändert Laufverhalten Trennung in nicht-denaturierendem Polyacrylamidgel 5`- Primer trägt Phosphatrest 17

18 SSCP Bakterium A Bakterium B G C A T G T G T

19 Datenanalyse I Profil-Vergleich Umwandlung SSCP- Muster in densiometrische Kurven Normalisierung des Gels Erstellung eines Dendogramms anhand statistischer Vergleiche Clustering der SSCP-Muster 19

20 SSCP Densiometrische Kurven SSCP- Gel 20

21 Datenanalyse I Profil-Vergleich 21

22 Datenanalyse II - Sequenzierung Ausschneiden der Banden von Interesse Reamplifikation der DNA Sequenzierung Datenbankanalyse 22

23 Datenanalyse II - Sequenzierung Sequenz BLAST 23

24 Datenanalyse III Southern Blotting Transfer der SSCP- Muster auf Membran Hybridisierung mit spezifischen DNA- Sonden Analyse von scheinbar gleichen Banden (Konformations-Isomere) Sensitiver als Färbemethoden Suche nach bestimmten Sequenzen bzw. Mikroorganismen 24

25 DGGE/ TGGE Unterscheidung von DNA-Molekülen derselben Länge aber unterschiedlicher Sequenz Trennung anhand des Schmelzverhaltens der PCR- Produkte Position der DNA im Gel analog zu Schmelztemperatur der DNA GC-Klammer verhindert vollständige Schmelze 25

26 DGGE 26

27 DGGE 27

28 ARDRA Amplifikation der vollständigen 16S rdna Schneiden der DNA mit unspezifischem Restriktionsenzym Unterschiedliche Bandenmuster je nach Sequenz Sequenzierung Geeignet um Bakterienstämme zu unterscheiden 28

29 ARDRA 29

30 trflp 5`- Primer mit Fluoreszenz markiert PCR-Produkt durch Restriktionsenzymen fragmentiert Elektrophorese im Sequenzierer 30

31 trflp Farbige Banden = unterschiedliche Sequenzen Rote Spirale = fluoreszierender Primer Kreise/Quadrate = Erkennungssequenz Restriktionsenzym 31

32 Vor-/ Nachteile Vorteile Nachteile Geringe DNA-Mengen ausreichend Erstellung und Vergleich von genetischen Profilen Spezifische Sequenzierungen Kontaminationsgefahr Amplifikationsfehler Heteroduplices Bevorzugte Amplifikation Kein direkter Vergleich zwischen den Methoden möglich 32

33 Zusammenfassung SSCP Konformation ss DNA DGGE/ TGGE Schmelzverhalten trflp/ ARDRA Fragmentgrößen Mustervergleich Sequenzierung/ Datenbankanalyse 33

34 Neuere Techniken Sequenzierung ganzer Genome Vergleichende Analysen unter Berücksichtigung der HGT s (horizontal gene transfers) Split trees 34