PCR (polymerase chain reaction)

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1 PCR (polymerase chain reaction) Definition: Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen 1

2 PCR-History Erfunden 1983 von Dr. Kary Mullis Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für Chemie Seit 1992 tausende Zitate in Publikationen PCR hat extrem viele Anwendungsgebiete (Vaterschaftstest, Gerichtsmedizin, Krankheitsnachweise, Sequenzierung..) 2

3 Prinzip PCR Welche Nukleinsäuresequenz soll amplifiziert werden? Welche DNA wird als Vorlage-Template verwendet (Genomische, cdna ) Primer setzen und suchen (Kriterien) Temperaturprogramm wählen DNA aus PCR Gemisch isolieren Weiterverwendung der isolierten DNA 3

4 Primer setzen und suchen Primer im Randbereich der zu amplifizierenden Sequenz setzen (5-3 Amplifikation) Komplementär zu je einem Strang Parameter: Primerlänge Ampliconlänge Schmelztemperatur (Verhältnis G:C zu A:T beachten!!) 3 clamp Primerdimere vermeiden 4

5 PCR-Gemisch Template DNA (100 ng cdna, 500 ng genomische DNA) Primer (10 µmolar) DNA-Polymerase Taq (Bakt Thermus aquaticus) dntps (Nukleosidtriphosphate) PCR-Puffer dd H2O Optionale Zusätze: MgCl2, DMSO 5

6 Temperatur- und Zeitprogramm Denaturieren zum Einzelstrang (94 C, 30 sec) Anhybridisieren der Primer (Annealing, 30 sec) kommt auf die Schmelztemperatur der Primer an: je höher die Temperatur umso spezifischer das PCR-Produkt Amplifizieren mittels DNA-Polymersase (72 C, 2-4 min) kommt auf Größe des Produkts an!! mittels hitzestabiler Taq-Polymerase (proof reading oder nicht?) 6

7 7

8 Kontrolle und Isolierung der DNA aus PCR Gemisch Gelelektrophorese: Wie groß ist das erwartete PCR-Produkt? Welches Agarosegel verwendet man (meist 0,7-2%)? Ist nur ein Produkt sichtbar oder mehrere? bei vielen Banden unspezifische PCR Ausschneiden der spezifischen DNA-Bande aus dem Gel Isolieren der DNA aus dem Gelstückchen (Kit) Sequenzierung 8

9 Laufrichtung DNA auf Agarosegel 9

10 Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches 10

11 Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches 11

12 Einsatzmöglichkeiten der PCR Amplifikation von DNA Bereichen cdna-klonierung und cdna-genbanken Herstellung von cdna-chips DNA-Foot- & Fingerprinting DNA und RNA (cdna)-sequenzierung Isolierung, Markierung und Mutagenisierung von DNA- Fragmenten Diagnostik: Gen-Diagnostik (genetische Erkrankungen) Krebsdiagnostik: genomische Translokationen Diagnostik infektiöser Krankheiten 12

13 REAL TIME PCR (= quantitative PCR (qpcr)) Real time PCR systems Fluorescence chemistry Analysis 13

14 Real time-pcr systems Real-time PCR for gene expression analysis Allows real time monitoring of PCR amplification products by use of fluorescence First step: Reverse transcription of RNA into complementary DNA (cdna) Mainly semi-quantitative measurement (qpcr) Highly sensitive Used in research lab and clinical diagnostic labs 1. halogen tungsten lamp 3. intensifier 5. CCD chip 2a. excitation filters 2b. emission filters 4. sample plate 14

15 Real time-pcr systems 15

16 Real time-pcr systems 16

17 Real time-pcr systems 17

18 Real time-pcr systems 18

19 Real time-pcr chemistries Importance of primers in PCR specific high efficiency no primer-dimers Ideally should not give a DNA signal cross exon/exon boundary EXON 1 INTRON 2 EXON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA 19

20 Real time-pcr chemistries Fluorescence chemistry for real-time PCR TaqMan TM probe uses FRET (Flueorescent resonance energy transfer): SybrGreen intercalating dye: 20

21 Molekulare BiomaterialsDiagnostik Real time-pcr chemistries TaqMan 21

22 Real time-pcr chemistries 22

23 Real time-pcr chemistries 23

24 Real time-pcr chemistries 24

25 Real time-pcr chemistries Fluorescence resonance energy transfer 25

26 Real time-pcr chemistries 26

27 Real time-pcr chemistries 27

28 Real time-pcr chemistries TaqMan reporter TaqMan reporter TaqMan quencher Passive dye 28

29 Real time-pcr chemistries 29

30 Real time-pcr chemistries 30

31 Real time-pcr chemistries 31

32 Real time-pcr analysis 32

33 Real time-pcr analysis Plotting PCR in real-time CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA PCR CYCLE NUMBER PCR CYCLE NUMBER 33

34 Reference genes same copy number in all cells expressed in all cells medium copy number advantageous correction more accurate reasonably large intron no pseudogene no alternate splicing in region you want to PCR 34 34

35 Importance of controls negative control (no DNA) checks reagents for contamination no reverse transcriptase control detects if signal from contaminating DNA positive control checks that reagents and primers work especially importance if trying to show absence of expression of a gene 35

36 Real time-pcr analysis Amplification curve to determine realtive expression values Output: relative fold-change (for semiquantitative qpcr) 36

37 Real time-pcr analysis Melting curve as quality control for SybrGreen assays 37

38 Diagnostic use of real-time PCR Quantitatively measurment of Human Immunodeficiency Virus (HIV) Detection of Thalassemia, hemophilia, sickle cell anemia & favism by real time PCR Cystic fibrosis Phenyl ketonuria Use in forensic medicine Noninvasive Prenatal Diagnosis by Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma Detection and Quantitation of Circulating Plasmodium falciparum DNA Effect of antimicrobial peptides on host cells 38

39 Pros and cons of real-time PCR Pros Simple Low cost Good sensitivity High dynamic range Cons Big reaction volumina Dependence on reference genes Limited specificity (especially with SybrGreen) No absolute quantification!!! Limited use for detection of allelic imbalances, exact copy number variations and rare mutations 39

40 Digital PCR Emulsion Array Chip 40

41 Digital PCR - Principle Sample partitioning via limited dilution Detection via fluorescent probes Read out: positive or negative reaction (0 or 1) Absolute quantification by counting of positive reactions 41

42 Emulsion-based system (QX100 Droplet Digital PCR, Biorad) 42

43 Array-based system (OpenArray Digital PCR, Life Technologies) 43

44 Array-based Capillary System (Biomark DigitalArray, Fluidigm) 44

45 dpcr facilitates detection and quantification of... Rare mutations Copy number variations Karyotypic events (cytogenetics) Low-level pathogens Gene expression in single cells Clonal amplification of nucleic acids 45

46 The PCR song 46