Molekularbiologische Methoden

Transkript

1 Molekularbiologische Methoden im Lebensmittel-Labor Dr. rer. nat. Armin Pahl LADR GmbH MVZ Dr. Kramer & Kollegen

2 DNA 1866 Gregor Mendel veröffentlicht seine Versuche über Pflanzen-Hybriden, die aber keine Beachtung finden Friedrich Miescher isoliert aus Zellkernen das Nuclein, dessen Aufbau und Funktion zunächst rätselhaft bleiben Richard Altmann identifiziert die Nucleinsäure und eine basische Proteinfraktion als Bestandteile des Nucleins Chromosomen werden als Träger der Erbinformation erkannt (W. Sutton) J. Watson und F. Crick postulieren die Doppelhelix-Struktur der DNA bis 1965 Dechiffrierung des genetischen Codes DNA-Sequenzierung (Frederick Sanger, Allan Maxam, Walter Gilbert) Kary Mullis entwickelt die Polymerase-Kettenreaktion Das erste prokaryotische Genom (von Haemophilus influenzae) ist sequenziert Das erste eukaryotische Genom, das der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, ist sequenziert Als Resultat des Humangenomprojektes steht die Referenzsequenz des menschlichen Genoms zum Download im Internet bereit Das 1000-Genome-Projekt wird gestartet er Marke erreicht Massively Parallel Sequencing: The Next Big Thing in Genetic Medicine

3 Bausteine der DNA

4 Aufbau der DNA

5 Die Richtung der RNA / DNA

6

7 Replikationsgabel

8 DNA Synthese Eine DNA Polymerase kann nur einen partiellen Doppelstrang verlängern. Es findet keine Initiation der DNA Synthese durch die DNA Polymerase eines Einzelstranges statt.

9 Polymerase Chain Reaction Denaturierung bei 95 C Primerhybridisierung bei 54 C Elongation durch TAQ-Polymerase bei 72 C Ende des ersten Zyklus

10 Taq-Polymerase Heiße Quelle: Thermus aquaticus. In fast allen PCR-Ansätzen der Welt finden sich heute so genannte Taq-Polymerasen aus dem Bakterium Thermus aquaticus. Dieser Mikroorganismus lebt in heißen Quellen bei etwa 70 C. Der erste T. aquaticus-stamm, aus dem Polymerasen für die PCR gewonnen wurden, stammte aus dem amerikanischen Yellowstone-Nationalpark.

11 Effizienz der PCR

12 DNA Gelelektrophorese Gelkammer Ethidiumbromid-gefärbtes Gel

13 GVO gentechnisch veränderter Organismus Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt. Artikel 2 der europäischen Freisetzungs- Richtlinie (2001/18/EG).

14 Gentechnisch veränderte Pflanzen

15 GVO Screening Das klassische qualitative Screening umfasst den 35S-Promotor (aus CaMV) und NOS-Terminator (aus Agrobacterium tumefaciens) und detektiert ca. 90% aller bekannten GVO-Pflanzen. (momentan!)

16 Gentechnisch veränderte Organismen

17 GVO Nachweis über PCR

18 P 35S: Promotor-Sequenz, stammt aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus. T-Nos: Terminator-Sequenz; stammt aus dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens. FMV: Promotor-Sequenz aus dem Braunwurzmosaikvirus (Figwort mosaic virus). CTP2-CP4-EPSPS: vermittelt Resistenz gegen das Herbizid Gylphosat (RoundUp Ready ) Bar: Gen, das Resistenz gegen den Wirkstoff Phosphinotricin (Totalherbizid) verleiht. Pat-syn: Bar und Pat unterscheiden sich bei gleicher Funktion in ihrer DNA-Sequenz.

19 P 35S: Promotor-Sequenz, stammt aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus. T-Nos: Terminator-Sequenz; stammt aus dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens. FMV: Promotor-Sequenz aus dem Braunwurzmosaikvirus (Figwort mosaic virus). CTP2-CP4-EPSPS: : vermittelt Resistenz gegen das Herbizid Gylphosat (RoundUp Ready ) Bar: Gen, das Resistenz gegen den Wirkstoff Phosphinotricin (Totalherbizid) verleiht. Pat-syn: Bar und Pat unterscheiden sich bei gleicher Funktion in ihrer DNA-Sequenz.

20 Glyphosat EPSPS: 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase

21 Real Time PCR PAC-Man TAQ-Man

22 TAQ Man Prinzip Hydrolysesonden

23 Realtime Salmonellen PCR

24 Interne Kontrolle der Salmonellen PCR

25 Botulinumtoxin (BTX) PCR- Nachweis

26 Listeria monocytogenes

27 Sanger Sequencing Gelelectrophoresis

28 Die Richtung der RNA / DNA

29 Didesoxynukleotide

30 Sanger Sequencing Gelelectrophoresis

31 S35 Sequenzierung

32

33 Automatisierte DNA Sequenzierung

34 Bestimmung von Bakterien mithilfe der 16S RNA Sequenzierung Amplifikation im konservierten Bereich der 16 s RNA ( bp) Sequenzierung des Amplifikats Abgleich der Sequenzen mit öffentlichen (z. B. Genbank-nicht verifizierte Daten), oder kommerziellen (Microsec verifizierte Daten) Datenbanken

35 Bestimmung von Bakterien mithilfe der 16S RNA Sequenzierung Vorteile: Keine spezifischen Primer notwendig universell anwendbar. Keine aufwendigen Bak.- Verfahren notwendig Hohe Erfolgsrate Nachteile: Teure Analysegeräte Reinkultur Qualität der öffentlichen Datenbanken Nicht alle Spezies besitzen eine eigene 16 S RNA Sequenz Kosten

36 Solid Chip

37 DNA-Chip für Tierartenbestimmung

38 Tierartennachweis Cytochrom b Gen Protein aus der Atmungskette 389 bp Fragment Interne Amplifikationskontrolle Hybridisierungskontrolle

39 Testablauf

40 Scannen und Evaluation Detection of Cy3-label at 532 nm (green) Detection of Cy5-label at 635 nm (red) orientation control printing control hybridisation control Hybridisation Horse Donkey Pig Orientation Goat Cattle Chicken PCR control species specific probe Sheep Turkey Orientation 40 PCR

41 Danke für die Aufmerksamkeit