DNA-Replikation. Konrad Beyreuther. Stefan Kins

Transkript

1 DNA-Replikation Konrad Beyreuther Stefan Kins

2 DNA-Replikation Originalgetreue Verdopplung des genetischen Materials als Voraussetzung für die kontinuierliche Weitergabe der in der DNA verschlüsselten Information von Generation zu Generation. Die Initiation der DNA-Replikation ist die Entscheidung pro- und eukaryotischer Zellen zu einer weiteren Teilung. Die Replikation ist auf der Ebene der Initiation reguliert. Die Zellteilung erfolgt erst nach Abschluss der Replikation.

3 Elektronenmikroskopische Aufnahmen eines Replicons Replikationsauge Zirkuläres Virusgenom während der Replikation 1µm

4 Die Replikation zirkulärer DNA erfolgt in der Regel bidirektional Ursprung EcoRI- Schnittstelle ringförmiges Viruschromosom Restriction mit EcoRI Replikationszeit

5 Die Replikation linearer DNA von Säugern erfolgt bidirektional Faserautoradiographische Untersuchung an DNA aus kultivierten Säugerzellen

6 2D-Gelelektrophorese

7 Struktur des Origins auf dem Genom von E.coli E.coli besitzt nur ein origin, das oric genannt wird ca. 280 bp lang 13-mer Sequenzen 9-mer Sequenzen (Bindung von dnaa) IHF/FIS Bindung (origins erlauben die Replikation beliebiger DNA-Sequenzen, in die sie ligiert werden) AT-reiche Sequenz Der Vergleich von origins aus mehreren Bakterienstämmen hat die Identifikation von konservierten Regionen erlaubt (PNAS, 1983)

8 Struktur des Origins auf dem Genom von Hefe Hefe besitzt mehrere origins, die ARS (autonom replizierende Sequenz) genannt werden ca. 180 bp lang AT-reiche Sequenz die core Sequenz (A site) ist essentiell für die Replikation (A/TTTTATA/GTTTA/T) DNA-Footprint Experimente haben gezeigt, dass an diesen Sequenzbereich ein Komplex aus 6 Proteinen (origin recognition complex, orc) bindet. Mutationen in einem der orc-proteine sind lethal. drei AT-reiche Sequenzen (B1, B2 und B3) erhöhen die Replikations-Effizienz, sind aber nicht essentiell.

9 Identifikation der Core-Sequenz des Hefe origins

10 Struktur des Origins auf dem Genom von Säugetieren Die Sequenzen sind AT-reich, aber nicht hoch konserviert bislang identifizierte origin haben eine Länge von bp in höheren Eukaryoten wurden Proteine mit hoher Homologie zu den aus Hefe bekannten orc-proteinen gefunden.

11 Beispiele für unidirektionale Replicons Mitochondriale Replikation: - die origins der beiden DNA-Stränge sitzen an verschiedenen Orten - Ausbildung eines D-Loops - Replikation eines parentalen DNA- Strang - Freisetzung und Aktivierung des zweiten origin - Es entstehen zwei zirkuläre DNA- Doppelstränge - einige Mitochondrien und Chloroplasten bilden 2 oder mehrere D-Loops aus

12 Beispiele für unidirektionale Replicons Lineare Replicons: - Bei Adenoviren und einigen Phagen Initiation der Replikation durch terminale Proteine - Terminales Protein ist über eine Phosphodiesterbindung mit einem Serin an dem 5 -Ende des DNA- Strangs verknüpft Duale Funktion des terminalen Proteins: Es trägt ein Cytidin Nukleotid als Primer und bindet die DNA-Polymerase

13 Wieviele Replicons gibt es in einem Genom? Organismus Anzahl der Replicons Länge kb Geschwindigkeit bp/min Bakterien Hefe Fruchtfliege Kröte Maus Pflanzen Die Replikation von E.coli dauert 42 min. Eukaryotische Replicons sind klein und die Replikationsgeschwindigkeit ist niedrig. Theoretisch könnte das Genom von der Maus in 1h repliziert werden, tatsächlich dauert es ungefähr 6h.

14 Bei höheren Eukaryonten sind nicht alle Replicons gleichzeitig aktiv frühe mittlere späte S-Phase

15 Der DNA-Replikationsapparat Generelle Eigenschaften von DNA-Polymerasen - können DNA nicht aufschmelzen - können nur bereits existierende DNA- oder RNA-Stränge verlängern (sie benötigen Primer) -DNA-Polymerasen katalysieren das Anhängen von Nukleotiden an das 3 -Hydroxylende der wachsenden Kette, sodass die Stränge nur in 5 3 -Richtung verlängert werden

16 Initiation der Replikation - werden temperatursensitive dnaa Mutanten unter nicht permissiven Temperaturen kuliviert, kommt es noch zum Abschluss der laufenden Replikation, nicht aber zur neuen Initiation der Replikation. -Der Prä-Priming-Komplex wird durch Bindung von SSBs (single strand binding proteins) stabilisiert. - Helikase DnaB beginnt mit der Entwindung der DNA unter Verbrauch von ATP.

17 Die DNA-Helikase -wird bei E.coli von dnab- Locus kodiert - hexameres Protein -Klammert sich um DNA- Einzelstrang im offenen Komplex - unter ATP Verbrauch wandern Helikasen in 5-3 Richtung entlang der DNA und trennen die Doppelstränge voneinander. -Werden temperatursensitive dnab-mutanten unter nichtpermissiven Temperaturen kultiviert, wird die DNA nicht weiter entwunden und es kommt zum Abbruch der Replikation - die Einzelstränge werden durch Bindung von SSBs stabilisiert

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19 Die Primase - katalysiert die RNA-Primer für die DNA-Synthese - bei Prokaryonten bindet die Primase an die Helikase (DnaB). Somit entsteht das Primosom - nach der Synthese eines kurzen RNA Primers dissoziiert die Primase wieder von dem Einzelstrang Organismus Primase Primerlänge E.coli Archaebakterien Hefe Drosophila Humane Zellen DnaG Polα - ähnlich Polα Polα Polα pppa(n)7-10 pppa(n)8-12 pppa(n)8-12 pppa(n)7-9 pppa(n)8

20 Die DNA-Polymerase

21 Die Ringklemme und der gamma-komplex -bakterielle Ringklemmenprotein besteht aus 2 UE (beta) - eukaryotische Ringklemmenprotein (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) besteht aus 3 UE - - steigert die Prozessivität der DNA- Polymerase III um Faktor Proteine des gamma-komplexes haben eine Hilfsfunktion: Sie erkennen den Übergang vom Einzel-zum Doppelstrang am Primer-Ende des Substrats und beladen die DNA mit dem beta-ring

22 Problem der Gegenläufigkeit der DNA-Stränge Theoretisches Modell Tatsächlicher Vorgang Okazaki-Fragmente Prokaryonten: Nukleotide Eukaryonten: ca. 200 Nukleotide

23 Ein einfaches Modell der Replikationsgabel 1. DnaB-Helikase entwindet die Doppelhelix in 5-3 Richtung (ATP-Verbrauch). 2. Einzelstrangbereiche werden durch SSB Proteine abgedeckt 3. Leitstrang: Pol III verlängert kontinuierlich das 3 -Ende des wachsenden DNA-Stranges 4. Folgestrang: Primase bildet kontinuierlich kurze RNA-Primer, die von der PolIII zu Fragmenten von Nukleotiden (Okazaki-Fragmente) verlängert werden. Die RNA Primer weden von der 5-3 Exonuklease der Pol I oder von der RNAaseH entfernt. Entstehende Lücken werden mit DNA aufgefüllt. 5. Die DNA-Ligase verknüpft schließlich aufeinander folgende Okazaki-Fragmente

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25 Modell der Replikationsgabel

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27 Der eukaryotische Replikationskomplex Identifikation verschiedener DNA-Polymerasen: alpha: bildet Komplex mit Primase und verlängert den RNA-Primer um ein kurzes Stück DNA, keine Exonuklease Aktivität beta: kann keine RNA-Primer als Startpunkt nehmen. Ist vermutlich an Reperaturprozessen beteiligt. gamma: kommt nicht im Zellkern, aber in Mitochondrien vor. delta: hat ähnliche Eigenschaften, wie die PolIII von E.coli epsilon: hat ähnliche Eigenschaften, wie die PolIII von E.coli Identifikation weiterer essentieller Proteine: PCNA: (proliferating cell nuclear antigen) analoge Funktion zu der beta-ue von PolIII bei E.coli RPA: (replication protein A) analoge Funktion zu SSB von E.coli, setzt sich aber aus drei Untereinheiten zusammen. RFC: (replication factor C) stimuliert die Aktivität der Polymerase alpha

28 Der eukaryotische Replikationskomplex

29 Wie wird das Ende der linearen DNA repliziert? Der Leitstrang wird bis zum Ende der DNA-Matrize synthetisiert. Der Folgestrang wird jedoch diskontinuierlich kopiert und kann deshalb nicht vollständig bis zum Ende repliziert werden.ohne speziellen Mechanismus würde der Folgestrang mit jeder Zellteilung verkürzt werden. Dies wird durch eine modifizierte reverse Transkriptase, die man Telomerase nennt, verhindert.

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