Mechanismus der DNA-Replikation

Transkript

1 Mechanismus der DNA-Replikation Hinweis: Im Atelier finden Sie das Video Die Replikation sowie die CD "The Nature of Genes". Das Video bietet einen guten Einstieg in das Thema; die CD macht mittels Tutorials und Aufgaben die wichtigsten Themen der Molekularbiologie leichter verständlich. Allgemeines DNA als Matrize Am Beispiel der Replikation wurde zu ersten Mal gezeigt, dass Makromoleküle mit Hilfe einer molekularen Matrize synthetisiert werden. Mit der Aufklärung der Struktur der DNA- Doppelhelix durch Watson & Crick wurde ersichtlich, wie die DNA als Matrize, d.h. als Vorlage für die Vervielfältigung und Weitergabe der genetischen Information dienen könnte. Jeder Strang der DNA ist komplementär zum anderen. Somit kann ein Strang als Matrize dienen und der zweite Strang kann aufgrund der Regeln für die Basenpaarung synthetisiert werden Dies soll am folgenden Beispiel klar werden: Wenn der folgende Strang als Matrize dient: 5'-AGCGTTAGCGATCAT-3' muss der neu synthetisierte Strang die Basenfolge 3'-TCGCAATCGCTAGTA-5' aufweisen, da A mit T und G mit C basenpaaren. Das Replicon Ein DNA-Abschnitt, der von einem Replikationsstartpunkt aus repliziert wird, heisst Replicon. Ein eukaryotisches Chromosom wird von mehreren Stellen aus repliziert, hat also mehrere Replicons. Die Replikation beginnt am am Origin (Ursprung, Startpunkt) und läuft, wenn sie einmal begonnen hat, solange weiter, bis das gesamte Replicon verdoppelt ist. 1

2 In E. coli (Bakterium) stellt das Genom ein einziges Replicon dar, d.h. die Initiation an einem einzigen Startpunkt führt zur Replikation des gesamten Genoms. Bakterien können zusätzlich noch Plasmide enthalten: ein Plasmid ist ein ringförmiges autonomes DNA-Molekül, das ein eigenes Replicon darstellt. Ebenso ist jede Phagen- oder Virus - DNA ein Replicon, das während des Infektionszyklus viele Male aktiviert werden kann. Replikationstypen Man kann sich verschiedenen Arten der Replikation vorstellen. Watson und Crick schlugen schon 1953 bei der Beschreibung der Doppelhelix folgenden Typ vor: Eine Doppelhelix (Mutterstrang) wird in ihre zwei Einzelstränge getrennt. Dabei entsteht eine Y-Figur mit einem doppelsträngigen Stamm und zwei zunächst einzelsträngigen Zweigen, deren Nukleotidfolgen als Matrizen für die Synthese neuer komplementärer Stränge dienen. An jedem von diesen mütterlichen Einzelsträngen wird nun durch spezifische Enzyme ein Tochterstrang synthetisiert. Diese Art der Replikation nennt man semikonservativ. Es gäbe theoretisch noch andere Arten der Replikation, beispielsweise die konservative Replikation. Bei dieser Form der DNA-Verdoppelung bliebe der ursprüngliche Doppelstrang erhalten und neben ihm würde ein neuer Doppelstrang synthetisiert (Abb.1). Bei der dispersen Replikation verteilen sich die Elternstränge gleichmässig auf die Nachkommen-Doppelstränge (Abb.2): Das Meselson-Stahl Experiment Matthew Meselson und Franklin Stahl zeigten1957, dass die DNA-Replikation semikonservativ verläuft. Sie züchteten E. coli Zellen über mehrere Generationen auf einem künstlichen Nährboden, welcher als Stickstoffquelle das "schwere" Stickstoff-Isotop 15 N an Stelle des "leichten" Isotopes 14 N enthielt. 2

3 Die DNA, welche 15 N-Isotope in ihren Bausteinen enthält, ist um etwa 1% schwerer als 14 N-DNA. Sie lässt sich mittels Zentrifugation in einem CsCl- Dichtegradienten von der 14 N-DNA trennen. Die E. coli Zellen, die 15 N-DNA enthielten wurden nun auf ein frisches Medium übertragen, welches nur das Isotop 14 N enthielt. Die 15 N-DNA diente nun als Elternmolekül für weitere Generationen. Meselson und Stahl liessen die Zellen solange wachsen, bis sich die Zellpopulation gerade verdoppelt hatte. Im CsCl-Gradienten ergab die DNA der ersten Tochtergeneration nur eine einzige Bande, woraus sich folgern liess, dass alle DNA-Doppelstränge gleich schwer sein müssen und jeder einen "alten Strang" ( 15 N) und einen "neuen" ( 14 N) haben muss. Damit sprach das Ergebnis gegen eine konservative Replikation. Darauf wurden die Zellen für eine erneute Verdoppelung in 14 N-Medium gesetzt und die DNA wiederum im CsCl-Gradienten analysiert. Das Resultat waren zwei Banden, eine mit der leichten 14 N-DNA und eine mit der gemischten 14 N/ 15 N-DNA. Somit war semikonservative Replikation für die DNA von E. coli bewiesen. Aufgabe: Nehmen Sie die Stränge der zweiten Generation des Experimentes oben und zeichnen Sie die DNA-Stränge der dritten Generation, die in einem 15 N-Medium entstehen würden, farbig auf. Lösung: S. 15 Hinweis: Weitere Informationen zum Meselson-Stahl Experiment finden Sie beim Posten Geschichte im Dokument-Nr. G4. 3

4 Replikations-Elemente Die Replikationsgabel Die Replikation beginnt an einem Startpunkt. Sie kann uni- oder bidirektional erfolgen, je nachdem ob sich eine oder zwei Replikationsgabeln vom Startpunkt (Origin) wegbewegen. Bei der bidirektionalen Replikation bewegen sich die beiden Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung: Mittels radioaktivem Thymin im Nährmedium (Experiment) fand John Cairns heraus, dass an einem oder beiden Enden der gebildeten Replikationsgabel die Elternstränge entspiralisiert und die aufgetrennten Stränge rasch repliziert werden. Experiment von John Cairns John Cairns gelang es, mittels der Technik der Autoradiographie die Replikation als hochgradig koordinierten Vorgang zu beschreiben, bei dem die Elternstränge aufgewunden und gleichzeitig repliziert werden. Er erzeugte radioaktiv markierte DNA in E. coli Zellen, indem er sie in einem Nährmedium kultivierte, welches an Stelle des normalen Thymins das mit Tritium ( 3 H) markierte Thymin enthielt. Er isolierte diese DNA, liess sie sich auf einem Elektronenmikroskop-Objektträger ausbreiten und überschichtete sie mit einer photographischen Emulsion. Binnen mehrerer Wochen erzeugten die radioaktiv markierten Thyminreste Bahnen aus Silberkörnchen, welche ein Abbild der DNA darstellten. Diese Bahnen zeigten, dass die DNA von E. coli aus einem einzelnen ringförmigen Molekül mit einer Länge von 1.7 mm besteht. Die radioaktiv markierte DNA, die während der Replikation aus der Zelle isoliert worden war, wies eine zusätzliche Schleife auf. Auf Grund des Vergleiches der DNA-Mengen in den Schleifen führte Cairns die zweite Schleife darauf zurück, dass zwei zu den Elternsträngen komplementäre Tochterstränge gebildet worden waren. DNA - Polymerasen In der Replikationsgabel synthetisiert ein Multienzymkomplex die beiden Tochterstränge. Dieser Enzymkomplex enthält neben anderen Proteinen die DNA - Polymerasen, welche Desoxynukleotide zu langen Polynukleotidketten verknüpfen. Das Bakterium E. coli enthält drei verschiedene DNA - Polymerasen, die meisten eukaryontischen Zellen dagegen deren fünf oder mehr, die sich in ihrer Struktur und Funktion unterscheiden. 4

5 DNA-Polymerasen bei E. coli Bezeichnung Aufbau Funktionen DNA-Polymerase I 1 Untereinheit 928 Aminosäuren 103 Kilodalton (kda) 3' - 5' Exonuclease, 5'-3'-Exonuclease, Entfernung von RNA-Primer, Reparatur von DNA-Schäden DNA-Polymerase II 88 kda Reparatur DNA-Polymerase III 10 Untereinh. (ca. 900kDa) DNA-Polymersae, Replikation DNA-Polymerasen in eukaryotischen Zellen DNA- Polymerase katalytische Untereinheit (kda) Andere Untereinheiten (kda) 3'-5'- Exonuclease nein Hauptfunktion Komplex mit Primase, Synthese kurzer DNA- Stücke nach Start durch Primase 40 - nein Reparatur von DNA ja mitochondriale DNA- Replikation ja Replikation, Reparatur 200 mehrere ja Replikation, Reparatur Die grundlegende Reaktion der DNA-Polymerasen ist immer dieselbe: Das Enzym katalysiert den nukleophilen Angriff der 3'-Hydroxylgruppe des Nucleotides am 3'-Ende des wachsenden DNA-Stranges auf das 5' α-phosphoratom des anzuhängenden 2'-Desoxynukleotid-5'- triphosphates: 5

6 Die allgemeine Reaktionsgleichung lautet: Für die Polymerisation (Verlängerung) sind zwei zentrale Voraussetzungen notwendig: Es braucht eine Matrize Es ist ein Primer (Startermolekül) erforderlich Ein Primer ist ein kurzer Nukleinsäurestrang mit einer freien 3'-Hydroxylgruppe am Ende. DNA- Polymerasen können nur Nukleotide an einen bereits vorhandenen Strang anfügen, nicht aber die Synthese eines neuen Stranges starten. Prozessivität Wenn die DNA-Polymerase an einen Primer gebunden und das erste Nukleotid angehängt hat, gibt es für sie zwei Möglichkeiten: entweder sie dissoziiert ab und lagert sich später wieder an oder sie bewegt sich auf der Matrize vorwärts und hängt weitere Nukleotide an. Diese Eigenschaften wird als Prozessivität einer Polymerase definiert: Der Grad der Prozessivität ist durch die Anzahl Nukleotide gegeben, die die Polymerase im Durchschnitt an den neuen Strang anhängt, bevor sie abdissoziiert. Die Prozessivität wird durch Anlagerung eines Proteinkomplexes an die DNA-Polymerase gesteuert. Aufgabe: Überlegen Sie sich, was die Prozessivität einer Polymerase steigern könnte. In der Lösung finden Sie die Angaben bezüglich der Prozessivität der drei DNA-Polymerasen von E. coli. Lösung: S. 15 Energieverhältnisse der Polymerisation Bei der Polymerisationsreaktion finden grundsätzlich zwei Reaktionen statt; einerseits wird ein Phosphorsäureanhydrid hydrolysiert (im Desoxynukleotidtriphosphat, dntp, von welchem Pyrophosphat abgespalten wird) und andererseits wird eine Phosphodiesterbindung gebildet und zwar an der 3'-OH Gruppe der neusynthetisiertenen DNA. Die Zucker-Phosphat-Bindung, welche neu geknüpft wird, ist energiearm, also in der Grössenordnung von 10-15kJ/mol: soviel ist aufzuwenden (+), wenn sie neu gemacht wird, soviel wird frei (-), wenn sie hydrolysiert wird. Die Polymerase hydrolysiert eine energiereiche Anhydridbindung und stellt damit gegen -30kJ/mol zur Verfügung. Es sollten also ca. -15kJ/mol freie Energie "übrigbleiben", wenn ein neues Nukleotid in die wachsende Kette eingefügt wird. Es ist aber sogar mehr! Basenpaarung und Basenstapelung tragen zur Sabilisierung der eingebauten Base bei: sie tragen um die -10kJ/mol freie Energie bei. Die Kopplung dieser Reaktionen bewirkt eine starke thermodynamische Triebkraft in Richtung der Polymerisation mit einem G von insgesamt etwa -25kJ mol -1. 6

7 Genauigkeit Die DNA-Polymerasen arbeiten sehr exakt: Bei E. coli tritt nur bei jedem 10 9 bis Einbau eines Nukleotids ein Fehler auf. Aufgabe: Das Genom von E. coli hat ca. 4.6x10 6 Basenpaare. Wieviele Replikationen des Genoms können stattfinden, bis ein Fehler auftritt? Lösung: S. 15 Während der Polymerisation beruht die Unterscheidung zwischen "richtigen" und "falschen" Nukleotiden auf den Wasserstoffbrücken, die eine korrekte Paarung zwischen den komplementären Basen festlegen. Falsche Basen können nicht die richtigen Wasserstoffbrücken bilden und werden damit zurückgewiesen. Dies allein reicht aber noch nicht aus, um die hohe Präzision der Polymerisation zu erklären. Die Fehlerrate wird in vivo durch zusätzliche enzymatische Mechanismen weiter reduziert, z.b. durch 3'-5'-Exonuclease-Aktivität. Sie ist eine eigenständige Aktivität der Polymerase. Diese Nukleaseaktivität ermöglicht es dem Enzym, ein gerade eingebautes Nukleotid wieder zu entfernen. Wenn ein falsches Nukleotid eingebaut wurde, ist die Weiterbewegung der Polymerase zur Bindungsstelle des nächsten Nukleotids blockiert. Durch die 3'-5'-Exonucleasewirkung wird das falsche Nukleotid entfernt und das korrekte Nukleotid eingebaut. Diese Funktion wird als Korrekturlesen bezeichnet. Die Richtung der Replikation Wir haben gesehen, dass ein Nukleotid immer an die 3'-Hydroxylgruppe des neuen Stranges angehängt wird und die neue Kette somit in 5'-3'-Richtung wächst. Diese Tatsache führt aber zu einem Problem: Wenn die Synthese immer in 5'-3'-Richtung vorwärts schreitet, wie können dann beide DNA- Stränge gleichzeitig synthetisiert werden? Stellen wir uns eine Replikationsgabel vor. Der Eltern-Doppelstrang wird aufgetrennt und dient als Matrize. Die beiden Stränge weisen aber nicht dieselbe Orientierung auf: da sie antiparallel angeordnet sind, weist der eine Strang eine 3'-5'-Orientierung auf und der andere eine 5'-3'- Orientierung. Sehen wir uns zuerst den 3'-5'-Elternstrang an, dieser kann in 5'-3'-Richtung direkt repliziert werden (gestrichelt): Der 5'-3'-Strang aber hat die "falsche" Richtung. Reiji Okazaki fand in den 60er Jahren heraus, dass an diesem Strang viele kurze Stücke in 5'-3'-Richtung synthetisiert werden, welche man nach ihm als Okazaki-Fragmente bezeichnet. Die Länge dieser Fragmente hängt vom Zelltyp ab und beträgt einige hundert bis zweitausend Nucleotide: 7

8 Somit wird der eine Strang kontinuierlich (Leitstrang) und der andere diskontinuierlich (Folgestrang) synthetisiert. Der kontinuierliche Strang ist derjenige, bei welchem die Synthese des neuen Stranges in der gleichen Richtung läuft wie die Replikationsgabel. Beim diskontinuierlichen Strang läuft die Synthese in die Gegenrichtung der Replikationsgabel. Vorgänge in der Replikationsgabel Bei der Replikation wirken in der Replikationsgabel neben der Polymerasen noch viele weitere Enzyme und Proteine mit, welche in ihrer Gesamtheit als DNA-Replikase-System resp. Replisom bezeichnet werden. RNA-Primase / DNA-Ligase Zu Beginn der Replikation wird ein Primer benötigt. Am Leitstrang kann von diesem Primer aus der neue Strang kontinuierlich gebildet werden, da immer ein basengepaartes Kettenende für die weitere Synthese zur Verfügung steht. Am Folgestrang jedoch kann die Polymerase nur eine kurze Zeit lang wirken, dann muss der Polymerisationsprozess weiter vorne von neuem beginnen. Dafür ist jedes Mal von neuem ein Primer nötig. Dieser basengepaarte Primer-Strang wird durch ein Enzym, die RNA-Primase, synthetisiert. Bei Eukaryonten haben die Primer eine Länge von ungefähr 10 Nukleotiden. Diese RNA- Stücke werden in Abständen am Folgestrang synthetisiert und anschliessend durch die DNA-Polymerase zu einem Okazaki- Fragment verlängert. Diese Synthese endet am 5'-Ende des vorhergehenden Fragments. Damit nun ein kontinuierlicher Strang entsteht, der keine RNA-Stücke enthält, tritt noch während der Replikation ein Reparaturmechanismus in Aktion: Eine RNase H (in E. coli Teil der DNA- Polymerase I) entfernt die RNA-Primer und eine DNA-Polymerase füllt die entstandene Lücke mit DNA. Die DNA-Ligase schliesst dann die Bindung vom 3'-Ende des neuen zum 5'-Ende des alten DNA- Stückes und beendet damit den Vorgang. 8

9 DNA-Ligasen bei Bakterien und Eukaryoten E. coli besitzt eine, Eukaryoten mindestens zwei verschiedene DNA-Ligasen. Ihre Funktion ist dieselbe, sie unterscheiden sich aber im Cofaktor. Während die Bakterien-Ligase NAD als Cofaktor benötigt, ist der Cofaktor von Eukaryoten-Ligasen ATP. Mechanismus: AMP (aus ATP oder NAD) bindet an die Lysin-Seitenkette des Enzyms Übertragung des AMP-Restes auf das 5'-Phosphatende der DNA Bildung der Phosphodiester-Bindung über den Angriff der 3'-OH-Gruppe auf das aktivierte 5'- Phosphatende DNA-Helicasen Damit die Replikation überhaupt ablaufen kann, muss der DNA-Doppelstrang (Elternstrang) getrennt werden. Dies bedeutet Schmelzen der DNA über einen kurzen Bereich. Das Entwinden wird von den DNA-Helicasen katalysiert, Enzymen, welche sich entlang der DNA bewegen und die Stränge mittels chemischer Energie aus ATP voneinander trennen. Bei dieser Hydrolyse kann die Form des Proteinmoleküls zyclisch verändert werden, so dass es mechanische Arbeit verrichten kann. Die freiliegenden DNA-Stränge werden durch DNA-bindende-Proteine stabilisiert. In Eukaryoten sowie Prokaryoten wurden bisher eine ganze Reihe von verschiedenen DNA- Helicasen gefunden. Die Einteilung der Helicasen erfolgt biochemisch nach der Polarität ihrer Bewegung (3'-5' oder 5'-3') oder nach Art des Substrats. Viele Helicasen benötigen beispielsweise überstehende Einzelstrangenden als Eintrittsstellen, während andere von Doppelstrangenden aus wirken können. DNA-Topoisomerasen Das Auftrennen der Stränge erzeugt topologisch bedingte Spannungen in der helicalen DNA- Struktur: Diese werden durch die Wirkung von Topoisomerasen beseitigt. Die Mithilfe bei der Replikation ist aber nur eine von vielen Aufgaben der Topoisomerasen. Bei allen Reaktionen, bei 9

10 denen die Topologie der DNA verändert wird, spielen die Topoisomerasen eine wichtige Rolle, also zum Beispiel bei der Transkription von Genen, bei der Rekombination u.a. Topoisomerasen öffnen vorübergehend den Phosphodiester-Rückgrat der Doppelhelix, leiten den einen DNA-Strang durch die entstandene Lücke und stellen dann die Phosphodiesterbindung wieder her. Das Ergebnis dieser Reaktion ist die Änderung der Windungszahl pro Längeneinheit und damit der Topologie der DNA. Im Wesentlichen arbeiten die Topoisomerasen der Eukaryoten und der Prokaryoten gleich. Hinweis: Sie finden weitere Informationen in der aufgelegten Brochure Topoisomerasen von Eukaryoten und Prokaryoten Aufgabe: Worin liegt der Unterschied in der Funktion einer DNA-Topoisomerase und einer DNA-Helicase? Lösung: S. 15 Mechanismus Die wesentlichen Vorgänge in der Replikationsgabel in Bakterien: Die DNA-Helicase bewegt sich in 5'-3'-Richtung entlang des Stranges, an den sie gebunden ist und entwindet die Doppelhelix unter Verbrauch von ATP. Die entstehenden Einzelstrang-Bereiche werden durch Einzelstrang-bindende-Proteine (SSB- Proteine) abgedeckt. Die DNA-Polymerase III heftet auf dem Leitstrang (Vorwärtsstrang) neue Desoxynukleotide an das 3'-OH-Ende des wachsenden DNA-Stranges. Auf dem Folgestrang (Rückwärtsstrang) bildet die Primase kurze RNA-Stücke (Primer), welche durch die DNA-Polymerase III zu Fragmenten von Nukleotiden verlängert werden. Die Primer werden von der 5'-3'-Exonuclease der Polymerase I entfernt und die entstehenden Lücken durch DNA ersetzt Die DNA-Ligase verknüpft aufeinanderfolgende Okazaki-Fragmente miteinander. 10

11 Initiaton Initiator-Protein-Komplexe binden an spezifische Stellen am Replikationsstartpunkt. Sie bilden einen grossen Proteinkomplex, welcher die DNA-Helicase bindet und sie zu einem freiliegenden DNA-Einzelstrang dirigiert. Zusätzlich bindet die RNA-Primase und bildet mit der Helicase das Primosom, welches sich dann vom Startpunkt wegbewegt und RNA-Primer für die erste DNA- Kette bildet. Daraufhin lagern sich rasch die übrigen Proteine zu einem Replikations- Proteinkomplex zusammen, der sich vom Startpunkt wegbewegt und zwei neue DNA-Stränge (kontinuierlich/diskontinuierlich) synthetisiert. DNA-Replikationsgabeln werden bei Bakterien an speziellen DNA-Sequenzen initiiert. Von diesen Punkten aus bewegen sich zwei Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung mit einer Geschwindigkeit von etwa 500 Nukleotiden pro Sekunde. Das Genom der Bakterien ist so klein, dass diese zwei Replikationsgabeln das gesamte Chromosom innerhalb von weniger als 40 Minuten replizieren können. Bei den Eukaryoten ist die DNA im Kern als Chromatin organisiert ist. Deshalb wird die Replikation der DNA von Veränderungen in der Chromatinstruktur begleitet: Entfaltung des Chromatins in der Umgebung der Replikationsgabeln Nukleosomen unmittelbar vor der Replikationsgabel verlieren ihre Histon H2A/H2B-Dimere, während die verbleibenden Histon H3/H4-Tetramere auf die neu replizierte DNA übertragen 11

12 werden. Hinter der Replikationsgabel werden die Tetramere durch Aufnahme von Histon H2A/H2B wieder zu intakten Nucleosomen zusammengefügt. Auf der replizierten DNA werden neu gebildete Histone H3/H4 mit den H2A/H2B Histonen zusammengebaut und neue Nukleosomen gebildet. Somit sind die Nukleosomen auf der replizierten DNA zur Hälfte aus den alten Histonen (des parentalen Stranges) und aus neu gebildeten Histonen zusammengesetzt. Die Geschwindigkeit mit der sich die Replikationsgabel von Eukaryonten bewegt, liegt bei ca. 50 Nukleotiden pro Sekunde, und das Genom ist etwa 1000 mal grösser. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, die Replikation von mehreren Replikationsstartpunkten aus zu beginnen, da die Replikation sonst mehrere Wochen dauern würde: Es werden immer mehrere Initiationspunkte aktiviert. Die Initiationspunkte haben einen Abstand von 30' '000 Basenpaaren. Die Replikationsgabeln bewegen sich von einem gemeinsamen Startpunkt weg und stoppen, wenn sie mit einer anderen Replikationsgabel zusammenprallen. Auf diese Weise können viele Replikationsgabeln gleichzeitig und unabhängig auf jedem Chromosom operieren und dabei zwei komplette Tochter-DNA-Helices synthetisieren. Kontrolle der Replikation Damit das gesamte Genom einer eukaryontischen Zelle beim Zellzyklus verdoppelt wird, muss die Replikation an vielen Origins gleichzeitig oder kurz nacheinander initiiert werden. Da alle Startpunkte "gezündet" werden, aber nicht alle Replicons gleichzeitig repliziert werden können, ergeben sich Probleme der Kontrolle. So müssen gewisse Merkmale replizierte von nicht replizierten Replicons unterscheidbar machen, damit bereits replizierte Replicons kein zweites Mal repliziert werden. Dies wird (kurz zusammengefasst) folgendermassen erreicht: Origins binden nach erfolgter Replikation einen Prä- Replikationskomplex (Eiweiss-Komplex) und bereiten so eine neue Replikation vor. Wenn die Zelle in einen neuen Replikationszyklus eintritt, werden in der späten G1-Phase spezifische Proteinkinasen synthetisiert und aktiviert, welche ihrerseits in der S-Phase die Prä-Replikationskomplexe aktivieren. Dies führt zur Replikation der DNA. Komponenten der Replikationskomplexe werden darauf inaktiviert und Proteinkinasen zerstört (Proteolyse). 12

13 Termination Prokaryoten: Bei der Termination treffen am Terminator zwei Replikationsgabeln aufeinander. Dadurch kann es bei ringförmiger DNA (E. coli) zur Ausbildung von sog. Catenan-Strukturen kommen. Der Terminator liegt gegenüber dem Origin. An die Terminatorsequenz bindet das Protein Tus (terminator utilization substance), das die DNA-Helicase blockiert und damit die Wanderung der Replikationsgabeln zum Stillstand bringt. Die beiden Nachkommen-DNA hängen noch über einen unreplizierten Abschnitt zusammen. Dieser kann direkt durch die Einwirkung einer Topoisomerase gelöst werden. Die entstehenden Lücken werden sofort aufgefüllt Oft beobachtet man aber eine weitergehende DNA-Synthese mit der Ausbildung von Catenanen (ineinander verhängte Ringe). Zur Auflösung der Catenane und zur Freisetzung der replizierten DNA ist die Typ-II-Topoisomerase notwendig. Hinweis: Im Atelier können Sie sich das Video "Replikation" ansehen. Eukaryoten: Telomere und Telomerase: Da eukaryontische Chromosomen linear sind, stellt die Replikation der Enden ein besonderes Problem dar. Eine einfache Überlegung zeigt, dass die von Primern vermittelte diskontinuierliche DNA-Synthese quasi automatisch zu einem Verlust endständiger DNA führen muss, weil zumindest der DNA-Abschnitt, an dem die Synthese des letzten RNA-Primers stattfindet, unrepliziert bleiben muss. Die Lösung dieses Problems ist durch die besondere Struktur der Chromosomen-Enden (Telomere) möglich: Telomere bestehen aus Folgen kurzer repetitiver DNA-Sequenzen. An den Enden der Chromosomen des Menschen und anderer Vertebraten findet man viele hundert bis über tausend 6-Nukleotid-Blöcke vor: z.b. die Folge 5'-TTAGGG-3' in monotonen Wiederholungen auf dem einen DNA-Strang und die entsprechende Komplementär-Sequenz auf dem anderen DNA-Strang. Die Telomere werden im Verlauf der vielen Replikationsrunden von normalen Säugetierzellen in Zellkultur und im Tier kürzer. Es handelt sich dabei um einen normalen und unvermeidlichen Alterungsprozess. Reifende Geschlechtszellen, Embryonalzellen, Zellen aus Tumoren und alle schnell proliferierenden Zellen dagegen enthalten ein Enzym, das den Abbau der Telomerenden ausgleicht. Das Enzym heisst Telomerase. Telomerase besteht aus zwei funktionellen Teilen, einem Proteinanteil und einer RNA von etwa 160 Basen. Die RNA enthält einen Sequenzabschnitt, der mit den Telomer-Wiederholungen Basenpaare ausbilden kann. Die RNA dient gleichsam als wandernde Matrize für die Synthese von Telomeren, wie aus dem folgenden Reaktionsablauf hervorgeht: 13

14 Es bilden sich Basenpaare zwischen dem überstehenden DNA-Ende und der Telomerase-RNA. Desoxynukleotide werden an das 3'-OH- Ende der DNA nach Massgabe der Matrizensequenz in der RNA angeheftet. Es findet eine Translokation der Telomerase mit der Bereitstellung neuer Matrizensequenzen statt. Quellennachweis Die Texte und Abbildungen des vorliegenden Scripts entsprechen den Seitenangaben aus folgenden Werken: Lehninger: "Prinzipien der Biochemie"; 2. Auflage; Spektrum Akademischer Verlag; ISBN : Seiten Knippers R.: "Molekulare Genetik"; 6. neubearbeitete Auflage; Georg Thieme Verlag Stuttgart. New York; ISBN , 1996: Seiten Albert et al: "Molekularbiologie der Zelle"; 2. Auflage; VCH Verlagsgesellschaft mbh, Weinheim (D); ISBN , 1990: Seiten , Lewin B.: "Gene";2. Auflage, ; VCH Verlagsgesellschaft mbh, Weinheim (D) 1991; ISBN : Seiten Hinweis: In der Lese-Ecke stehen Ihnen Lehrbücher zum vertieften Studium zur Verfügung 14

15 Lösungen Zeichnen Sie die DNA-Stränge der dritten Generation, die in einem 15 N-Medium entstehen würden farbig auf. Als Ausgangs-DNA dient diejenige der zweiten Generation. Das Resultat sieht folgendermassen aus: Überlegen Sie sich, was die Prozessivität einer Polymerase steigern könnte. Die Prozessivität einer Polymerase hängt von der Dauer der Bindung an die Matrize ab. Je länger sie bindet, desto grösser ist die Zahl der angehängten Nukleotide und damit die Prozessivität. Als Beispiel sollen die DNA-Polymerasen von E. coli dienen: Prozessivität (angehängte Nukleotide vor dem Abdissoziieren) Polymerisationsgeschwindigkeit (angehängte Nukleotide / Sekunde) Polymerase I Polymerase II > 10'000 ca. 7 Polymerase III > 500' '000 Das Genom von E. coli hat ca. 4.6x10 6 Basenpaare. Wieviele Replikationen des Genoms können stattfinden, bis ein Fehler auftritt? Bei E. coli kommt alle 1'000 bis 10'000 Replikationen ein Fehler vor Worin liegt der Unterschied in der Funktion einer DNA-Topoisomerase und einer DNA- Helicase? Die Topoisomerase überwindet die Superwindung der DNA, indem sie einen Strang spaltet, abwickelt und wieder verschliesst. Damit macht sie die DNA der Helicase zugänglich, die nun die Stränge voneinander trennen kann. Uebungsaufgaben mit Lösungen finden Sie in der Internetversion des Ateliers! Hinweis: Das Repetitorium Molekularbiologie definiert den Stoff, welcher in den Prüfungen verlangt wird. Wegen seiner Kürze eignet es sich allerdings nicht als primäre Informationsquelle! 15