KV: DNA-Replikation Michael Altmann

Transkript

1 Institut für Biochemie und Molekulare Medizin KV: DNA-Replikation Michael Altmann Herbstsemester 2008/2009

2 Übersicht VL DNA-Replikation 1.) Das Zentraldogma der Molekularbiologie 1.) Semikonservative Replikation 2.) Matrizengesteuerte DNA-Synthese 3.) DNA-abhängige Primase 4.) Kontinuierlich vs. diskontinuierlich 5.) Koordinierte Synthese an der Replikationsgabel 6.) Abschliessende Schritte der DNA-Synthese 7.) Ligation von DNA 8.) Problematik bei der Replikation linearer DNA 8.) Funktion der Telomerase 9.) Replikationsursprünge 10.) Negatives Supercoiling 11.) Topoisomerasen 12.) Transition und Transversion 13.) Prinzip der DNA-Reparatur 14.) Homologe Rekombination bei der Meiose: Crossing-over

3 Das Zentraldogma der Molekularbiologie DNA-Replikation RNA DNA Transkription Translation Protein RNA DNA cdna reverse Transkription Protein RNA-Replikation T.A. Brown, Moderne Genetik (2. Auflage 1999), Abb. 4.7

4 Semikonservative Replikation Meselson-Stahl-Experiment (1958): Beide Tochterzellen erhalten je einen DNA- Strang der Mutterzelle Die Replikation ist ein sehr genauer Prozess (Fehlerrate )

5 Matrizengesteuerte DNA-Synthese Syntheserichtung: immer 5 ->3, Ableserichtung: immer 3 ->5 Antiparalleler Verlauf des neu synthetisierten Stranges Die DNA-Polymerase braucht zur Synthese eine abzulesende Matrize und einen Primer, ein kurzes RNA-Stück mit einem freien 3 -OH Ende

6 DNA-abhängige Primase Primase: DNA-abhängige RNA-Polymerase, die den Primer für die DNA-Synthese polymerisiert RNA-Polymerasen brauchen keinen Primer

7 Kontinuierlich vs. diskontinuierlich DNA-Synthese an der Replikationsgabel: Wegen der 5 ->3 Syntheserichtung wird der eine Strang (Leit- oder Vorwärtsstrang) kontinuierlich, der andere Strang (Folge- oder Rückwärtsstrang) diskontinuierlich synthetisiert

8 Koordinierte Synthese an der Replikationsgabel DNA-Synthese an der Replikationsgabel: Die zu replizierende Doppelhelix wird mit Hilfe von DNA-Helicasen geöffnet (nicht gezeigt). Enzelstrang-Bindungsproteine verhindern, dass die Doppelhelix wieder vor dem Ablesen zuschnappt. Die DNA-Polymerase ist ein Enzymkomplex, der aus zwei synthetisierenden Untereinheiten und der Primase besteht. Beide Stränge werden simultan synthetisiert. Trick : Da sich die Replikationsgabel von der Syntheserichtung am Folgestrang wegbewegt, bildet der Folgestrang eine Schleife, um gleichzeitig abgelesen werden zu können.

9 Abschliessende Schritte der DNA-Synthese DNA-Polymerasen können nicht nur synthetisieren, sie können auch DNA- oder RNA- Stücke entfernen (Korrekturfunktion). Es gibt sowohl eine 5-3 -Exonuklease wie eine 3-5 -Exonuklease-Aktivität (nicht jede DNA- Polymerase hat beide Aktivitäten). Die 5-3 -Exonukleaseaktivität der DNA- Polymerase I entfernt die RNA-Primer und füllt die Lücken auf. Die letzte 3 -OH / 5 -Phosphat Lücke zwischen zwei benachbarten Nukleotiden wird mit Hilfe der DNA-Ligase geschlossen.

10 Ligation von DNA Für die Schliessung der Lücke muss die 5 -Phosphat Bindung erst mit Hilfe von ATP aktiviert werden. Dabei wird zuerst AMP an ein Lysin-Rest am aktiven Zentrum der Ligase angehängt. Die DNA-Ligase knüpft vorübergehend eine Phosphosäureanhydrid-Bindung am 5 - Phosphat (durch Anhängen von AMP), die den nukleophilen Angriff der freien 3 -OH Gruppe und die Bildung der 3-5 -Bindung unter Abspaltung von AMP begünstigt.

11 Problematik bei der Replikation linearer DNA

12 Funktion der Telomerase (eine reverse Transkriptase) Das Ende der Chromosomen besteht aus repetitiven DNA-Sequenzen (hier: TTAGGG) Die Telomerase, eine RNA-abhängige DNA- Polymerase, bringt eine zur repetitiven DNA- Sequenz komplementäre RNA mit. Die angelagerte RNA dient als Matrize um den oberen DNA-Strang zu verlängern Im letzten Schritt wird die ursprüngliche Lücke mit Hilfe der DNA-Polymerase und -Ligase aufgefüllt. Nicht alle Zellen enthalten Telomerase, deshalb werden je nach Zelltypus pro Teilung die Chromosomen kürzer.

13 Replikationsursprünge Für den Beginn der Replikation wird mindestens ein Startpunkt gebraucht, vor allem wenn -wie bei vielen Prokaryoten- die DNA ringförmig ist. Trotz der hohen Polymerisationsgeschwindigkeit der DNA-Polymerase (mehrere Hundert Nukleotide pro Sekunde), braucht es bei Eukaryoten mehrere Replikationsursprünge, an denen die DNA- Synthese gleichzeitig stattfindet. Die DNA-Synthese ist an jedem Replikationsursprung bidirektional, d.h. dass beide DNA-Stränge abschnittsweise kontinuierlich und diskontinuierlich abgelesen werden.

14 Negatives Supercoiling Die Torsion während der Öffnung der Doppelhelix bei der Replikation erzeugt Überdrehungen/Superwindungen der DNA, da diese nicht frei um sich selber rotieren kann. Diesem Phänomen sagt man Supercoiling. Die rechtsdrehende B-DNA wird gegen den Uhrzeiger-Sinn entwunden, d.h. die Zahl der Helixwindungen hinter der Replikationsgabel reduziert sich = negatives Supercoiling. Demgegenüber stauen sich vor der Replikationsgabel die DNA-Überdrehungen = positives Supercoiling.

15 Topoisomerasen Topoisomerasen sind Enzymkomplexe, die den Torsionsstress beseitigen. Dazu schneiden sie mittels ihrer DNA-Endonuklease-Aktivität einen (Toposiomerase I) oder beide (Topoisomerase II) parentale DNA-Stränge in der Nähe der Replikationsgabel. Die gelösten DNA-Stränge können nun gegeneinander rotieren und die Spannung gelöst werden. In einem Folgeschritt verschliesst die Topoisomerase die Bruchstellen.

16 Transition und Transversion Mit einer geringen Frequenz (10-4 ) kommt es wegen Keto-Enol-Gleichgewichten zu ungewöhnlichen Basenpaarungen (G-T in der Abb.). Wenn nicht von der DNA-Polymerase erkannt, führen diese ungewöhnlichen Basenpaarungen in der nächsten Generation zu einer Punktmutation (G-C gegen A-T ausgetauscht). Ein Austausch eines Purins oder eines Pyrimidins gegen das andere (G->A; C->T) wird als Transition bezeichnet, der Austausch eines Pyrimidins gegen ein Purin (oder umgekehrt; zb. A->C) als Transversion. Dank 3-5 -Exonukleaseaktivität der DNA- Polymerase passieren solche Punktmutationen während der Replikation nur mit einer Frequenz von 10-7.

17 Prinzip der postreplikativen DNA-Reparatur Durch Einwirkung äusserer Faktoren (Chemikalien, UV-Licht, Hitze) kommt es nach der Replikation zu chemischen Veränderungen von Basen der DNA. Neben der Korrekturfunktion der DNA- Polymerase gibt es sog. postreplikative Korrekturmechanismen, die sowohl die Fehlerrate während der Replikation erniedrigen (10-10!) wie auch postreplikative Schäden korrigieren. Dazu dienen spezialisierte Enzymkomplexe, die die DNA abtasten und nach Fehlern/Mutationen absuchen. Ein häufig verwendetes Prinzip ist das der Nukleotid-Excisionsreparatur. Nach Identifizierung des Defektes wird ein Stück Einzelstrang herausgeschnitten, mit Hilfe der DNA-Polymerase und -Ligase eingefüllt und ligiert.

18 Homologe Rekombination bei der Meiose: Crossing-over Rekombination Trotz der hohen Replikationsgenauigkeit gibt es definierte Situationen, wo DNA-Veränderungen gewünscht werden, so zb. während der Meiose von Geschlechtszellen (zwecks Erhöhung der Varianz der Nachkommenschaft). Allerdings handelt es sich beim sog. Crossing-over um den exakten Austausch von gleichen DNA- Regionen zwischen homologen Chromosomen von Vater und Mutter, für die wiederum ein spezialisierter Enzymkomplex gebraucht wird.

19 Ortsgerichtete (somatische) Rekombination In manchen somatischen Zellen kommt es zur Umordnung (Deletionen, Rearrangement von DNA) gewisser Gene oder sogar von Gengruppen. Das bekannteste Beispiel ist die programmierte Umordnung der Antikörpergene des Immunsystems. Dieser Vorgang, der in B- und T- Lymphozyten passiert, erlaubt es, mit einem minimalen Repertoir an Genen, eine enorme Auswahl von mehr als verschiedenen Antikörperproteinen anzubieten. Die variablen Regionen der Antikörper-Ketten, welche die Spezifität ausmachen, werden während der Reifung der B-Lymphozyten durch ein Rearrangement gewisser DNA-Segmente (in der Abb. L, V, J) aus einem vorgegebenen Repertoir zusammengelegt. Ein ähnliches Verfahren der DNA- Rekombination wie bei den B-Zellen kommt bei den T-Zellen zur Maximierung der möglichen T- Zell-Rezeptoren vor.