1. Beschreiben Sie die Rolle der folgenden Proteine bei der DNA- Replikation in E. coli:

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1 1. Beschreiben Sie die Rolle der folgenden Proteine bei der DNA- Replikation in E. coli: Übung 7 - DnaA bindet an 13 bp DNA Sequenz (DnaA Box, 5 Wiederholungen bei E. coli) im oric ori wird in AT reicher Region aufgeschmolzen Rekrutierung von Helicasen - Helicase ATP-abhängige Aufschmelzung der DNA Doppelhelix - Topoisomerase Aufhebung des Verdrillens der DNA - DNA-Ligase ATP-abhängige Verknüpfung offener Enden der DNA (bei E. coli ist Enzym NAD + abhängig!) - DNA-Polymerase I Auffüllen der Lücken zwischen Okazaki Fragmenten - DNA-Polymerase III Replikation der DNA

2 2. Erklären Sie den Begriff Überspiralisierung (supercoil). Übung 7 L = Kopplungszahl (hier 20 vollständige Windungen der DNA Doppelhelix) Zusätzliche helicale Windung einer ringförmigen DNA Doppelhelix

3 Übung 7 3. Was sind Isotope? Welche Isotope wurden im Experiment von Meselsohn und Stahl eingesetzt und zu welchem Zweck? Könnten diese Isotope auch für Faserautoradiographie- Experimente eingesetzt werden? Begründen Sie Ihre Antwort und Erklären Sie das Prinzip der Methoden (Autoradiographie und die Methode die im Experiment von Meselsohn und Stahl eingesetzt wurde). Isotope sind Nuklide (Atomsorten) mit gleicher Ordnungszahl, aber unterschiedlicher Massenzahl. Der Name (griech. ισο [iso] gleich, τόπος [topos] Ort) kommt daher, dass Isotope eines und des selben Elements im Periodensystem am gleichen Ort stehen. In der Nuklidkarte erscheinen sie jedoch getrennt. Isotope enthalten also in ihren Atomkernen eine gleiche Anzahl von Protonen, aber verschiedene Anzahlen von Neutronen. Der Begriff Isotop wurde von Frederick Soddy geprägt, der für seine Arbeiten und Erkenntnisse im Bereich der Isotope und radioaktiven Elemente 1921 den Nobelpreis für Chemie erhielt. In der Regel besitzt jedes natürlich vorkommende Element ein oder wenige stabile Isotope, während seine übrigen Isotope radioaktiv (das heißt instabil) sind und früher oder später zerfallen. Es gibt jedoch auch Elemente, bei denen alle Isotope instabil sind.

4 Übung 7 Meselson-Stahl Experiment Matthew Meselson / Franklin Stahl (1958): Wachstum von E. coli in Medium mit CsCl-Dichtegradienten Zentrifugation: niedrige Dichte 15 N Isotop ( schwerer Stickstoff ) Einbau von 15 N in DNA Basen CsCl bildet bei hoher Zentrifugalkraft ( rpm) einen Ionengradienten hohe Dichte Überführung der Zellen in Medium mit 14 N Extraktion der DNA vor, nach einer und nach zwei zusätzlichen Zellteilungen CsCl Dichtegradienten Zentrifugation

5 Übung 7 4. Wie funktioniert das Korrekturlesen bei der DNA-Replikation? Leiten Sie daraus eine Begründung ab, warum RNA-Primer und nicht DNA-Primer bei der DNA-Replikation synthetisiert werden.

6 Übung 7 5. Wird beim Beginn der Vorwärtsstrangsynthese zuerst ein Primer gebildet? Wird beim Beginn der Vorwärtsstrangsynthese zuerst ein Okazaki-Fragment gebildet?

7 Übung 7 6. E. coli hat ein zirkuläres Chromosom aus doppelsträngiger DNA, das durch DNA-Replikation vollständig (inklusive allerletztes Basenpaar) verdoppelt wird. Wenn das Chromosom linear wäre, könnten bestimmte Bereiche an den Enden dieses Chromosoms mit der in der Vorlesung vorgestellten Replikationsmaschinerie nicht vollständig verdoppelt werden. Welche Bereiche können nicht vollständig verdoppelt werden (Skizze)? Warum können diese Bereiche nicht verdoppelt werden? nicht replizierter Bereich nicht replizierter Bereich

8 Übung 7 7. Mithilfe von gereinigter DNA-Polymerase können im Reagenzglas (in vitro) DNA-Kopien erstellt werden, in denen modifizierte Nukleotide (z.b. radioaktive Isotope oder mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierte Basen enthaltend) eingebaut sind. Die resultierenden markierten DNA-Fragmente können dann zum Beispiel als Sonden in Hybridisierungsexperimenten eingesetzt werden. Wie würden Sie vorgehen bei der Herstellung eines markierten DNA-Fragmentes? Beschreiben Sie die wichtigsten Schritte und möglichst alle der benötigten Komponenten. Klenow Fragment: Spaltung der DNA-Polymerase I mit Protease (Subtilisin); großes Fragment behält 5-3 Polymerase und 3-5 Exonuklease Aktivität; 5-3 Exonuklease Aktivität fehlt

9 8. Sie bekommen den Auftrag einen Vaterschaftstest durchzuführen. Beschreiben Sie das Vorgehen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Übung 7

10 Mikrosatelliten (2 14 bp): in der Regel 2 4 bp, die mal wiederholt auftreten = STR (short tandem repeat) Detektion individueller Mikrosatelliten über PCR mit flankierenden primern Übung 7 PCR fingerprint Anwendung z.b. bei Vaterschaftstests