Was war in der Molekularbiologie Die Entdeckung Amerikas?

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1 Was war in der Molekularbiologie Die Entdeckung Amerikas? A 1953 paper by James Watson and Francis Crick in the journal Nature began with two sentences that ushered in a new age of biology: We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest.

2 1869 isolierte Friedrich Miescher aus den Kernen von Leukozyten (Eiter) eine organische Substanz, die aus Phosphor und Stickstoff bestand. Er bezeichnete diese Substanz als Nuclein

3 The structure of DNA had been a subject of intense debate since 1944 when Avery et al. showed that DNA is the hereditary substance. Although the general composition of DNA was known, it was not known how all the parts fit together. The structure must fulfill the two main requirements for a hereditary molecule, the ability to store information and the ability to replicate.

4 Quelle: Stryer

5 A 1953 paper by James Watson and Francis Crick in the journal Nature began with two sentences that ushered in a new age of biology: We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest.

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21 Hypochromismus der DNA Einzelsträngige DNA absorbiert Licht effizienter als doppelsträngige helicale DNA. Die Absorbtion von DNA in Lösung steigt bei 260 nm an, wenn die DNA-Doppelhelix in Einzelstränge aufgeschmolzen wird.

22 DNA wird semi-konservativ repliziert!!

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27 Resolution of 14 N DNA and 15 N DNA by density-gradient centrifugation. (A) Ultraviolet absorption photograph of a centrifuge cell showing the two distinct bands of DNA. (B) Densitometric tracing of the absorption photograph. Detection of Semiconservative Replication of E. coli DNA by density-gradient centrifugation The position of a band of DNA depends on its content of 14 N and 15 N. After 1.0 generation, all of the DNA molecules were hybrids containing equal amounts of 14 N and 15 N. [From M. Meselson and F. W. Stahl. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44(1958):671.]

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29 Der leading strand wird kontinuierlich in 5 -> 3 Orientierung in Richtung der Replikationsgabel synthetisiert. Der lagging strand wird in kleinen Fragmenten (Okazaki-Fragmente) rückwärts, von der Replikationsgabel weg, synthetisiert. Die einzelnen Okazaki-Fragmente werden anschließend durch DNA-Ligase verbunden. Quelle Cooper: The Cell, a molecular approa

30 Die DNA Polymerase I entfernt RNA-Primersequenzen mit ihrer 5-3 Exonukleaseaktivität und füllt die Lücken zwischen den Okazaki-Fragmenten mit DNA. Die DNA-Fragmente werden dann von einer Ligase kovalent verknüpft. Quelle Cooper: The Cell, a molecular approa

31 Ein Gen wird durch die RNA Polymerase von DNA in mrna umgeschrieben (Transkription) mrna wird durch die Ribosomen in Protein umgeschrieben (Translation) Aber wie findet die RNA Polymerase das Gen?

32 Quelle Cooper: The Cell, a molecular approa

33 Enhancer-Effekt Der Immunglobulin-Enhancer Quelle Cooper: The Cell, a molecular approa

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35 Reinigung von DNA Aufschluss der Zelle Extraktion der Proteinfraktion mit äquilibriertem Phenol (Zusatz von Chloroform und Isoamylalkohol) Präzipitation der gereinigten DNA mit Ethanol Lösen der DNA in geeignetem Puffer (z.b. Tris/EDTA) (eventuell weitere Reinigung über CsCl Gradient)

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37 Restriktions- Modifikationssysteme

38 Restriktionsenzyme Restriktionsendonukleasen DNA bindende Proteine Hydrolysieren Phosphodiester-Bindungen an bestimmten Sequenzmotifen Bindungs- und Schnittstellen können gleich oder unterschiedlich sein Endonukleasen erkennen und schneiden interne Sequenzmotive Exonukleasen schneiden schrittweise von den Enden 3 Arten von Endonukleasen Typ I und Typ III schneiden und modifizieren DNA durch Methylierung wenn die DNA modifiziert ist, ist sie gegen die Nukleaseaktivität geschützt Bindungs- und Schnittsetelle sind unterschiedlich brauchen ATP, um sich an der DNA entlang zu bewegen Im Labor kaum brauchbar Typ II haben nur Restriktionsaktivität, keine Modifikationsaktivität Schnittstelle ist benachbart oder innerhalb der Erkennungssequenz Schnittstellen sind vorhersagbare Sequenzmotive kein ATP-Verbrauch Im Labor sehr nützlich!!

39 Erkennungstellen von Restriktionsendonukleasen 4 8 bp lang Palindrome (inverted repeats) BamHI 5 GGATCC3» 3 CCTAGG5 3 Arten von Schnitten: Schnitt in der Mitte: blunt end Schnitt 5 von der Mitte: 5 Überhang (sticky end) Schnitt 3 von der Mitte: 3 Überhang (sticky end) Sticky end Enzyme kreieren komplementäre Überhänge die hybridisieren können

40 Erkennungsstellen für 4 Restriktionsendonukleasen

41 Mehr als 200 Restriktionsenzyme sind derzeit kommerziell erhältlich Beispiel: EcoRI E= Genus Escherichia co= Spezies coli R= Stamm RY13 I= erste identifizierte Endonuklease aus diesem Organismus

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54 Sac 1 BamH 1 BamH1/Sac 1 GATCC G TC CGAG GATCC G GATCC G CTCG GA CTCG GA CTCG GA G CCTAG * *? BamH 1 MCS Sac 1 G 3 CCTAG 5 5 TC 3 CGAG Amp r ori DNA Ligase

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56 Wie kommt die DNA in die Zelle? Herstellung kompetenter Bakterien (Chemisch / Elektro-kompetent) Transformation von Plasmid-DNA (heat shock / Elektroporation) Selektion transformierter Bakterien (falsch positive Klone??)

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58 BamH1 Sac 1 BamH1 Sac 1

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60 Analyse von rekombinanten Klonen? BamH 1 Sac 1 BamH1/Sac 1

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67 Analyse von rekombinanten Klonen? BamH 1 400bp Sac 1 BamH1/Sac 1 2,9 kb + _

68 Abb. Stryer Figure Electron Micrographs of Circular DNA from Mitochondria. (A) Relaxed form. (B) Supercoiled form. [Courtesy of Dr. David Clayton.]

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