DNA- Rekombinationstechnik. Gentechnik

Transkript

1 DNA- Rekombinationstechnik Gentechnik 1

2 Verwendung von Plasmiden in der Gentechnik Campbell

3 Die wichtigsten Schritte bei der DNA-Klonierung (Plasmid) Transformation 3

4 Durch Klonierung kann man DNA-Fragmente in reiner Form isolieren DNA-Fragmente Vektoren Konstruktion rekombinanter Moleküle Jede Kolonie enthält zahlreiche Kopien eines einzigen rekombinanten DNA-Moleküls 4

5 Das Handwerkszeug der Molekularbiologen Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen) Ligasen DNA-Vektoren (leiten sich von Plasmiden ab) Wirtsorganismen 5

6 Restriktionsendonukleasen: Enzyme, die DNA schneiden Bakterien bekämpfen eindringende Viren (Fremd-DNA) mit Restriktionsendonukleasen Purves et al

7 Restriktionsendonukleasen erkennen bestimmte Abfolgen von Sequenzen auf der DNA -> Restriktionsschnittstellen Enzym EcoRI (aus Escherichia coli Stamm R) erkennt 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 und schneidet versetzt 5 -G AATTC-3 3 -CTTAA G-5 Diese Sequenz ist ein Palindrom: z. B. Otto oder Anna Wörter, die von vorn und hinten gelesen gleich lauten Janning & Knust 19.2b 7

8 EcoRI erzeugt kohäsive (klebrige, engl. sticky) Enden 5 -G AATTC-3 3 -CTTAA G-5 Die kurzen einzelsträngigen Enden sind komplementär PvuI aus (Proteus vulgaris) erzeugt glatte (engl. blunt) Enden 5 -CGATCG-3 3 -GCTAGC-5 5 -CGA TCG-3 3 -GTC AGC-5 8

9 Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme Janning & Knust

10 10

11 Die gleichen klebrigen Enden erzeugt von verschiedenen Restriktionsendonukleasen Die Enden sind kompatibel! 11

12 Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese DNA negativ geladen wandert zum positiven Pol kürzere Fragmente wandern schneller als längere Sichtbarmachen der DNA Fragmente durch Ethidiumbromid und UV-Licht 12

13 Die Erkennungssequenz von EcoRI GAATTC kommt statistisch in einem prokaryotischen Genom ca. alle 4000 Bp vor Ein prokaryotisches Genom von bp (4 Mbp) würde in ca Fragmente zerlegt werden 13

14 Analyse von DNA Fragmenten durch den Southern-Blot Denaturierung in Einzelstränge Purves et al

15 stabile Hybride erlauben die Detektion komplementärer Sequenzen 15

16 Autoradigram 16

17 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Genetischer Fingerabdruck Forensik 17

18 Zerschneiden und Verknüpfen von DNA Molekülen Purves et al

19 Ligasen verknüpfen DNA Moleküle (DNA Replikation) in der Gentechnologie T4 DNA-Ligase: Cofaktor ATP aus dem Phagen T4 glatte Enden + überhängende Enden : sehr ineffektiv glatte Enden + glatte Enden : annehmbare Ausbeuten zwei passende überhängende Enden: sehr effektiv 19

20 allgemeine Eigenschaften von Vektoren - Befähigung zur autonomen Replikation (ori) - relativ geringe Größe (< 10 kb) mit singulären Schnittstellen (Polylinker) in nicht essentiellen Bereichen - hohe Kopienzahl - selektionierbarer Marker (Antibiotika Resistenz) Multiple Klonierungssetlle (Polylinker) 20

21 Antibiotika Stoffe die Mikroorganismen am Wachstum hindern (bakteriostatisch) oder abtöten (bakteriocid); z. Zt. mehr als 7000 bekannt wichtige Klassen: Penicilline (aus Pilzen): Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese (z.b. Ampicillin) Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin (aus Bakterien) Hemmung der Proteinsynthese Resistenzgene wirken verschiedenartig: z.b. amp (β-lactamase): Spaltung des Penicillin-Ringes CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase) tet: Hemmung der Aufnahme von Tetracyclin in Bakterien 21

22 Klonierung mit pbr322 22

23 Plasmide mit dem lacz Gen Plasmid α-kompementation Bakterielles DNA-Molekül α lacz mit Deletion α-fragment (inaktiv) Rest der β-galaktosidase (inaktiv) Plasmid University of California aktive β-galaktosidase 23

24 Blau-Weiß-Selektion in E. coli ΔM15 lacz Gen mit Deletion Protein Synthese AS1-146 AS11-41 fehlen DNA wird in multiple Klonierungsstelle kloniert α-fragment komplett β Galaktosidase aktiv Protein Synthese α-fragment defekt β Galaktosidase inaktiv 24

25 lacz H 2 O ß1->4 Künstlicher Induktor Künstliches Substrat Indigo-Farbstoff 25

26 Blau-Weiß-Selektion in E. coli 26

27 Klonierung eines menschlichen Gens in ein bakterielles Plasmid Campbell

28 Wie findet man ein bestimmtes Gen? 28

29 Herstellung einer Gen-Bibliothek Menschliches Genom bp Mbp Plasmide können ca bp Fremder DNA aufnehmen mindestens Klone! Tatsächlich > Purves et al

30 Problem: Introns Eukaryotsiche Gene sind sehr groß und durch Introns unterbrochen Prokaryotische Organismen haben keine Introns, können eukaryotsiche Gene nicht exprimieren Lösung: cdna = komplementäre DNA Campbell

31 Isolierung von mrna durch Oligo(dT) Zellulose Reverse Transkription der poly(a)mrna durch Reverse Transkriptase Poly(A)Schwanz Janning & Knust 19.8 mrna Purves et al

32 Identifizierung des Klons, der das gewünschte Gen trägt mit einer Koloniefilter-Hybridisierung Campbell

33 Sequenzierung: Kettenabbruchverfahren nach Sanger Autoradiogramm Janning & Knust

34 Automatische DNA-Sequenzierung Fluoreszenz-Markierung 4 Spuren auf dem Gel 4 Reaktionen mit Fluoreszenz-Markierung Jeder Base ist ein Farbe zugeordnet Janning & Knust 19.16, verändert 34

35 Die Polymerasekettenreaktion PCR: (engl. polymerase chain reaction) Jedes beliebige Molekül kann in vitro amplifiziert werden ca. 50 C 94 C ca. 50 C 72 C 72 C 94 C ca. 50 C 94 C Purves et al

36 Jeder PCR-Zyklus hat 3 Schritte: Denatureierung der DNA (94 C) Hybridisierung der Primer (annealing C) Synthese der neuen DNA-Stränge durch Taq-Polymerase (72 C) Exponentieller Vorgang Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus aus heißen Quellen des Yellowstone-National-Park USA 1 Molekül DNA nach Zyklus 1: 2 Moleküle nach Zyklus 2: 4 nach Zyklus 3: 8 nach Zyklus 4: 16 nach Zyklus 5: 32 nach Zyklus 6: 64 nach Zyklus 7: 128 nach Zyklus 8: 256 nach Zyklus 9: 512 nach Zyklus 10: 1024 Nach Zyklus 20:

37 Ein Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines fremden Gens in E. coli Purves et al

38 Medizinisch wirksame Produkte in der Biotechnologie Produkt Faktor VIII Wachstumshormon Insulin Anwendung Ersetzt den fehlenden Blutgerinnungsfaktor bei Patienten mit Hämophilie A Ersetzt das Hormon bei Menschen mit geringem Wuchs Für Menschen mit Diabetes Gewebeplasminogenaktivator Löst nach Herzinfarkten und Schlaganfällen Blutgerinnsel auf 38

39 Synthese des TPA-Proteins (Gewebeplasminogenaktivator) in E. coli zur Behandlung von Schlaganfallpatienten Purves et al

40 Synthese von Proteinen in der Bäckerhefe Hey, this bug makes wine, beer and bread! Why work with anything else? Sprossung Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) 40

41 Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) Wichtigster domestizierter Pilz (>6000 Jahre bekannt) Wein-, Back- oder Brauhefe Setzen in Abwesenheit von Sauerstoff Zucker zu Alkohohl (Ethanol) und CO 2 um 41

42 Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) Vorteile Wichtigster domestizierter Pilz (>6000 Jahre bekannt) Wein-, Back- oder Brauhefe Einzelliger Eukaryot -> eukaryotische Genexpression! Kurze Generationszeit (ca. 2h) Kann sowohl als Haplont als auch als Diplont existieren 42

43 Klonierung von Hefegenen durch Komplementation von E. coli -Mutanten 43

44 Integrierendes Hefeplasmid Kopiezahl: 1 bis wenige, nicht autonom replizierbar Bakterieller Replikationsursprung ( origin of replication ) Selektierbarer Hefemarker (z.b. LEU2) YIp Selektierbarer bakterieller Marker (z. B. Amp R ) Yeast integrating plasmid klonierte Region von Interesse 44

45 Gezielter Einbau von DNA mit Hilfe homologer Rekombination 45

46 Gen-Austausch durch homologe Rekombination 46

47 Das 2μm-Plasmid von S. cerevisiae in fast allen S. cerevisiae Stämmen (im Kern) (cir + -Stämme, cir 0 -Stämme) biologische Funktion unbekannt 6318 bp = 2 μm Kopien, 2-3 % der Gesamt-DNA 4 ORFs Replikationsursprung 47

48 Hefeplasmid Kopiezahl: ca. 50 ( multicopy ), autonom replizierbar Schaukel-Vektor ( Shuttle-Vector ) Vektor, der in verschiedenen Wirtssystemen vermehrt werden kann Bakterieller Replikationsursprung ( origin of replication ) Selektierbarer Hefemarker (z.b. LEU2) Replikationsursprung S. cerevisiae 2μm Plasmid DNA oder Replikationsursprung des 2μm Plasmids Selektierbarer bakterieller Marker (z. B. Amp R ) klonierte Region von Interesse z.b. Gen des Menschen 48

49 künstliches Hefechromosome (YAC) YAC (Yeast artificial Chromosome ) Kopiezahl: 1, autonom replizierbar Klonierung großer DNA Fragmente Telomer ARS Selektion E.c Centromer Klonierte Region Slektionsmarke S.c Telomer Replikationsursprung Aufnahme von 50 kb bis zu 1000 kb 49

50 Arabidopsis thaliana = Ackerschmalwand 50

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52 Protoplasten-Transformation PEG; Ca 2+ + DNA Regeneration 52

53 Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens Wurzelhalsgalle 53

54 Prinzip des Gentransfers von Agrobakterien in Pflanzenzellen Seyffert Abb D-9 54

55 Erzeugung transgener Pflanzen mit Hilfe des Ti-Plasmids T-DNA (23 kb) Ti-Plasmid Ti (Tumor induzeirendes) Plasmid T (transferred) DNA Janning & Knust 2004;

56 Biolistische Transformation von Pflanzen Druckkammer Träger für Partikel Auffanggitter DNA-beschichtete Partikel Petrischale mit Pflanze 56

57 Transgener Goldreis enthält einen hohen Anteil an β Carotin Goldreis Warum? Mittel gegen Vitamin A-Mangel (in Entwicklungsländern Asiens häufig Ursache für Erblindung) Einbringung von drei artfremden Genen: zwei Gene der Osterglocke und eins von aus dem Bakterium Erwinia uredovora. Durch diese Veränderung kommt es zur Bildung von ß-Carotin (Provitamin A) im Endosperm der Reiskörner, die deshalb (gold-)gelb / orange gefärbt sind. Wird der Reis in Verbindung mit Fetten verspeist kann das Provitamin aufgenommen werden und wird dann im Körper zu Vitamin A umgewandelt. 57

58 Viel Erfolg im weiteren Studium!! 58