Gentechnologie fur Einsteiger

Transkript

1 T. A. Brown Gentechnologie fur Einsteiger 6. Auflage ubersetzt von Sebastian

2 Grundprinzipien der Klonierung und 1 1 Klonierung und DNA-Analyse so wichtig? 3 Friihe Entwicklungen in der Genetik Die Entwicklung der und die Was ist DNA-Klonierung? Was ist Warum sind DNA-Klonierung und PCR so wichtig? Isolierung eines Gens in Klonierung 7 PCR kann man Gene reinigen Ein Wegweiser durch dieses Buch 9 Weiterfiihrende Literatur 2 Klonierungsvektoren: und Bakteriophagen Plasmide GroBe und Kopienzahl 13 und Klassifikation von Plasmide in anderen Bakterien Bakteriophagen Der, Lysogene Phagen Viren als Klonierungsvektoren fur andere Organismen 21 Weiterfiihrende Literatur 21 3 Die von DNA aus lebenden Zelien Die Preparation der und Ernte einer Bakterienkultur Die von Zellextrakten Die Reinigung der DNA aus Zellextrakt Das Anreichern der DNA-Proben Die der DNA-Konzentration Andere zur der gesamten Zell-DNA Die von 30 Trennung aufgrund der GroBe 31 Trennung aufgrund der Die von Bakteriophagen-DNA Die Zucht von Kulturen mit hohem Preparation nichtlysogener Die Ernte der Phagen aus einer infizierten Kultur Die Reinigung von DNA aus M13-DNA sich leicht reinigen 38 Weiterfiihrende Literatur 39

3 VIII 4 Die Manipulation der gereinigten DNA Das Spektrum der Enzyme zur Nucleasen Ligasen Polymerasen Enzyme Schneiden der DNA:Restriktionsendonucleasen Entdeckung und Wirkungsweise der Restriktionsendonucleasen Die Restriktionsendonucleasen II schneiden die DNA an ganz Nucleotidsequenzen Glatte Enden und klebrige Enden Die der Restriktionserkennungsstellen in Der einer Restriktionsspaltung im Labor Die Analyse des Ergebnisses einer Restriktionsspaltung bei Die Kartierung der Restriktionsschnittstellen auf einem DNA-Molekul Besondere zur Trennung groberer Molekule Ligation: Das Verbinden von Die Wirkungsweise der DNA-Ligase Klebrige Enden die Effizienz der Ligation Das Anfugen klebriger Enden an ein mit glatten Enden Ligation glatter Enden mit einer 62 Weiterfiihrende Literatur 63 5 Das Einfuhren von DNA in Transformation: Die Aufnahme von DNA durch Bakterienzellen Bakterienarten nehmen DNA mit der gleichen Effizienz auf Die Die Selektion Zellen Die Identifizierung von Rekombinanten Selektion von Rekombinanten mit pbr322: Inaktivierung durch Einbau eines Antibiotika-Resistenzgens Die Inaktivierung durch Einbau von DNA betrifft nicht Antibiotikaresistenzen Das Einfuhren von Phagen-DNA in Bakterienzellen Transfektion Die Phageninfektion wird in Form von Plaques auf einem sichtbar Die Identifizierung rekombinierter Phagen Inaktivierung eines im Phagenvektor durch die eingebaute DNA Inaktivierung des von A Selektion mit des Phanotyps Spi Selektion anhand der von A Einschleusen von DNA in eukaryotische Zellen Transformation einzelner Zellen Transformation ganzer Organismen Weiterfiihrende Literatur

4 Inhaltsverzeichnis Klonierungsvektoren fur E. 79 Klonierungsvektoren auf der Grundlage von E. 80 Die Nomenklatur von Die Eigenschaften von pbr Der von pbr Weiterentwickelte E. co/;'-plasmid-klonierungsvektoren Klonierungsvektoren auf der Grundlage des Bakteriophagen M Die Konstruktion eines Phagen-Klonierungsvektors Hybridvektoren aus und M Klonierungsvektoren auf der Grundlage des Bakteriophagen A Aus A-Genom kann man Stucke entfernen, ohne die Funktionsfehigkeit zu beeintrachtigen Durch naturliche Selektion kann man A-Phagen isolieren, denen Restriktionsstellen fehlen Insertions- und Substitutionsvektoren Klonierungsexperimente mit oder A-Substitutionsvektoren Sehr grobe kann man in klonieren Mit A- und anderen Vektoren mit hoher Kapazitat kann man genomische Bibliotheken konstruieren Vektoren fur andere Bakterien 93 Weiterfiihrende Literatur 94 7 Klonierungsvektoren f iir Eukaryoten Vektoren fur Hefe und andere Selektierbare Marker fur das Vektoren auf der Grundlage 2-Mikron-Ringes: Episomale Plasmide der Ein YEp kann sich in die DNA der Hefe integrieren Andere Mit kunstlichen Chromosomen kann man riesige DNA-Stucke in Hefe klonieren Vektoren fur weitere Hefearten und andere Pilze Klonierungsvektoren fur hohere tumefaciens: Der kleinste»natiirliche Gentechniker« DNA-Klonierung in Pflanzen durch direkte Genubertragung Versuche Einsatz von Pflanzenviren als Vektoren Klonierungsvektoren Klonierungsvektoren fur Insekten Klonierung in Seugetieren 110 Weiterfiihrende Literatur Die Gewinnung eines von einem Gen Das Problem der Selektion Es gibt zwei grundlegende Wege, den gesuchten ausfindig zu Direkte Selektion Marker rescue erweitert die Anwendungsmoglichkeiten der direkten Selektion Anwendungsbereich und Grenzen des Die Suche nach Klonen in einer Genbibliothek Genbibliotheken Nicht Gene werden zur gleichen Zeit exprimiert 120

5 8.33 sich als DNA klonieren Methoden zur Identifizierung von Klonen Nucleinsaurestrange hybridisieren untereinander Kolonie- und 8.43 Beispiele fur den praktischen Einsatz der Nucleinsaurehybridisierung Methoden zur Identifizierung eines Gens durch den Nachweis seines Genprodukts Weiterfiihrende Literatur Die (PCR) Die Polymerasekettenreaktion im Die PCR: einige Einzelheiten Die Konstruktion der fur die PCR Die richtige Nach der PCR: Die Analyse der Produkte Gelelektrophorese der PCR-Produkte Klonierung von PCR-Produkten mit der Fehlerhaufigkeit der Mit der kann man die Menge des quantitativ erfassen Der Ablauf eines Experiments mit quantitativer PCR Mit Realtime-PCR kann man auch quantitativ erfassen 144 Weiterfiihrende Literatur 145 Die Anwendung von Klonierung und DNA-Analyse in der Forschung Die Sequenzierung von Genen und Methoden zur DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzierung nach Kettenabbruchverfahren Pyrosequenzierung Die Sequenzierung eines Das Schrotschussverfahren zur Das Karten als Sequenzaufbau 162 Weiterfiihrende Literatur Die Untersuchung der Genexpression und Genfunktion Die Analyse von Genen Nachweis eines Transkripts und Aufklarung seiner Transkriptkartierung durch Hybridisierung zwischen Gen und RNA Transkriptanalyse durch Primerverlangerung Transkriptanalyse mit PCR Die Untersuchung der Expressionsregulation von Genen Der Nachweis von Proteinbindungsstellen an einem DNA-Molekul Der Nachweis von Regulatorsequenzen durch Deletionsanalyse Nachweis und Untersuchung des Translationsprodukts eines klonierten Gens 179

6 Mit HRT und HART kann man das Translationsprodukt eines klonierten Gens nachweisen 2 Analyse der Proteine durch in 181 Weiterfiihrende Literatur Annotation von Genomen Identifizierung von Genen in einer Genomsequenz der Funktion eines unbekannten Gens Analyse von Transkriptom und Proteom Transkriptomanalyse Untersuchungen am Proteom Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen 199 Weiterfiihrende Literatur 201 Anwendungen der Klonierung und DNA-Analyse in der Biotechnologie Die Proteinproduktion mit klonierten Genen Spezielle Vektoren die Expression fremder Gene in E Der ist der entscheidende Bestandteil eines Expressionsvektors Kassetten und Fusionsgene Probleme mit der gentechnischen Proteinproduktion in E. coli Probleme durch die Sequenz des Probleme durch E.coli Gentechnische Proteinproduktion mit Eukaryotenzellen Gentechnische Proteinherstellung mit Hefe und Fadenpilzen Gentechnische Proteinproduktion rekombinante Proteine aus lebenden Tieren und Pflanzen 218 Weiterfiihrende Literatur Klonierung und DNA-Analyse in der Medizin Gentechnische Arzneimittelproduktion Gentechnisch hergestelltes Insulin Synthese menschlicher Wachstumshormone in coli Gentechnisch hergestellter Faktor VIII Gentechnische Herstellung anderer menschlicher Proteine Gentechnisch hergestellte Identifizierung krankheitserzeugender Gene Menschen Die Identifizierung eines krankheitserzeugenden Gens Gentherapie Gentherapie genetisch bedingter Krankheiten Gentherapie und Krebs Ethische Aspekte der Gentherapie 238 Weiterfiihrende Literatur 239

7 XII Inhaltsverzeichnis 15 Klonierung und DNA-Analyse in der Landwirtschaft Das Hinzufugen von Genen bei Pflanzen Pflanzen, die eigene Insektizide produzieren Herbizidresistente Nutzpflanzen Andere Projekte, bei denen Gene wurden Inaktivierung von Genen Antisense-RNA und die gentechnische Verenderung der Reifung von Tomaten Weitere Beispiele fur den Einsatz der Antisense-RNA in der Pflanzengentechnik Probleme mit gentechnisch veranderten Pflanzen Sicherheitsuberlegungen im Zusammenhang mit selektierbaren Markern Das Terminatorverfahren Die Frage nach schadlichen Auswirkungen auf die 256 Weiterfiihrende Literatur Klonierung und DNA-Analyse in Gerichtsmedizin und Archaologie DNA-Analyse zur Identifizierung Tatverdachtiger Herstellung genetischer Fingerabdriicke durch Hybridisierung DNA-Typisierung durch PCR Verwandtschaftsnachweis durch DNA-Typisierung Verwandte haben ehnliche DNA-Typisierung und die sterblichen Oberreste der Romanows durch DNA-Analyse PCR spezifischer Sequenzen aus Y-Chromosom PCR des Archaogenetik: bei der Erforschung der menschlichen Vorgeschichte Die Entstehung der Jetztmenschen Anhand der DNA kann man auch prahistorische Wanderungsbewegungen nachzeichnen 270 Weiterfiihrende Literatur 272 Glossar