Molekularbiologische / gentechnische Methoden

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1 Molekularbiologische / gentechnische Methoden MPM 1 Wie lässt sich ein spezifisches Gen/Genprodukt molekular analysieren? Fundamentales Problem: Komplexität biologischer Systeme MPM 2

2 Ein Ausschnitt aus dem Hauptchromosom von E. coli. MPM 3 Genom von Escherichia coli MPM 4

3 Wie lässt sich ein spezifisches Gen/Genprodukt molekular analysieren? Fundamentales Problem: Komplexität biologischer Systeme. Lösung: Vereinfachung des Systems MPM 5 Wie lässt sich ein spezifisches Gen/Genprodukt molekular analysieren? Problem: ein Genom enthält eine praktisch unüberschaubare Menge an genetischer Information. Idealerweise sollte das Genom zur Analyse in "handliche" DNA- Abschnitte zerlegt, die einzelnen Abschnitte isoliert und jeder einzelne Abschnitt als reine Population vermehrt werden. Dafür stehen 2 gängige Methoden zur Verfügung: 1. Das Klonieren des gesuchten DNA- Abschnitts. 2. Die Polymerasekettenreaktion: hierfür wird allerdings Sequenzinformation vom zu analysierenden Gen benötigt. MPM 6

4 Prinzip des Molekularen Klonierens MPM 7 Wie zerlegt man die genomische DNA in definierte Abschnitte? Wie bekommt man ein Genfragment ins Plasmid? Wie überträgt man das Plasmid ins Bakterium? Das Verfahren beginnt mit einer hochkomplexen Mischung von Genfragmenten. Wie stellt man sicher, dass als Ergebnis des Prozederes reine Populationen von Plasmiden mit jeweils nur einer Sorte "Insert" vorliegen? Welche Sorte Plasmidvektor verwendet man? MPM 8

5 Wie zerlegt man die genomische DNA in definierte Abschnitte? Wie bekommt man ein Genfragment ins Plasmid? Wie überträgt man das Plasmid ins Bakterium? Das Verfahren beginnt mit einer hochkomplexen Mischung von Genfragmenten. Wie stellt man sicher, dass als Ergebnis des Prozederes reine Populationen von Plasmiden mit jeweils nur einer Sorte "Insert" vorliegen? Welche Sorte Plasmidvektor verwendet man? MPM 9 Klonierungsvektoren Moderne Klonierungsvektoren sind von den ursprünglichen R- Plasmiden abgeleitet Die Plasmidgröße wurde drastisch reduziert Elemente wurden deletiert, die einen interbakteriellen Plasmid-Transfer per Konjugation vermitteln (OriT und tra-gene) Der Replikationsursprung ist so mutiert, dass im Falle der puc- Vektoren Kopienzahlen von 800 Plasmiden pro Zelle erreicht werden MPM 10

6 Wie zerlegt man die genomische DNA in definierte Abschnitte? Wie bekommt man ein Genfragment ins Plasmid? Wie überträgt man das Plasmid ins Bakterium? Das Verfahren beginnt mit einer hochkomplexen Mischung von Genfragmenten. Wie stellt man sicher, dass als Ergebnis des Prozederes reine Populationen von Plasmiden mit jeweils nur einer Sorte "Insert" vorliegen? Welche Sorte Plasmidvektor verwendet man? MPM 11 Transformation Beim Klonieren werden die Plasmide nicht durch Konjugation sondern durch Transformation in die Bakterien übertragen. Transformation von Bakterien = Aufnahme und Replikation von Plasmid-DNA und deren stabile Weitergabe an die Tochtergenerationen Problem: E. coli ist von einer festen Hülle (bestehend aus 2 Membranen und der Zellwand) umgeben, die nicht einmal kleine Ionen frei passieren können. D.h. der Transfer der DNA ist normalerweise ein sehr seltenes Ereignis Bakterien, die DNA aufnehmen und durch sie transformiert werden können, werden als kompetent bezeichnet Die Labormethoden zur Transformation von Bakterien fallen in zwei Kategorien: 1. Methode der chemisch-kompetenten Zellen, bei den die Bakterien mit alchimistisch anmutenden Mischungen exotischer Salze, wie Calcium- oder Rubidiumchlorid etc. behandelt werden. Wahrscheinlich wird die Zellhülle dabei permeabler. Kombination mit einem Hitzeschock, d.h. plötzlicher Temperatursprung auf 42 C 2. Elektroporation: hier wird die DNA durch einen kurzen Puls hoher elektrischer Feldstärke ( 1.5x10 6 V/m) in die Bakterien eingebracht MPM 12

7 Transformation Selektion Selbst bei den effizientesten Transformationsmethoden wird nur ein verschwindender Bruchteil der Bakterienpopulation transformiert. Die Selektion auf Transformanten ist daher essentieller Teil der Prozedur. Das Plasmid muss daher einen selektierbaren Marker (Auxotrophiemarker oder Antibiotikarestistenz) enthalten. Die gängigste Methode geht von einem Antibiotika-sensitiven Bakterienstamm und einem Plasmid mit Antibiotika-Resistenz aus. Nur Transformanten können dann in Gegenwart des Antibiotikums wachsen. MPM 13 Transformation Selektion Praktisch wird der Transformationsansatz auf einer Agarplatte ausplattiert, die Nährmedium und das Antibiotikum enthält. Resistente Bakterien bilden Kolonien. MPM 14

8 Wie zerlegt man die genomische DNA in definierte Abschnitte? Wie bekommt man ein Genfragment ins Plasmid? Wie überträgt man das Plasmid ins Bakterium? Das Verfahren beginnt mit einer hochkomplexen Mischung von Genfragmenten. Wie stellt man sicher, dass als Ergebnis des Prozederes reine Populationen von Plasmiden mit jeweils nur einer Sorte "Insert" vorliegen? Welche Sorte Plasmidvektor verwendet man? MPM 15 Klonieren Transformation ist ein sehr seltenes Ereignis Aufnahme von zwei Plasmiden in die selbe Zelle sehr unwahrscheinlich Inkompatibilität verhindert stabile Propagation zweier Plasmide mit dem gleichen ori und Segregationsapparat. Die Selektion auf z.b. Antibiotikaresistenz stellt sicher, dass nur Bakterien mit Plasmid wachsen. Die transformierten Bakterien werden in geringer Dichte auf einer Agarplatte ausplattiert. Einzelne Bakterien wachsen dann jeweils zu einer Kolonie heran. Eine Kolonie besteht aus genetisch identischen Nachkommen (Klone) eines einzigen Bakteriums. Eine Bakterienkolonie sollte daher eine reine Population eines Plasmids (und damit eines Inserts) enthalten. MPM 16

9 Transformation Selektion Praktisch wird der Transformationsansatz auf einer Agarplatte ausplattiert, die Nährmedium und das Antibiotikum enthält. Resistente Bakterien bilden Kolonien. Eine Kolonie umfasst genetisch identische Nachkommen (Klone) eines einzigen Bakteriums und ist von einem einzigen Plasmidmolekül abgeleitet. MPM 17 Wie zerlegt man die genomische DNA in definierte Abschnitte? Wie bekommt man ein Genfragment ins Plasmid? Wie überträgt man das Plasmid ins Bakterium? Das Verfahren beginnt mit einer hochkomplexen Mischung von Genfragmenten. Wie stellt man sicher, dass als Ergebnis des Prozederes reine Populationen von Plasmiden mit jeweils nur einer Sorte "Insert" vorliegen? Welche Sorte Plasmidvektor verwendet man? MPM 18

10 Restriktionsendonucleasen (Restriktionsenzyme) Sämtliche Restriktionsenzyme erkennen spezifische Sequenzen und spalten beide DNA-Stränge. Es gibt 3 Klassen von Restriktionsenzymen, jedoch werden nur die Typ II Enzyme (zu denen EcoRI gehört) in der Gentechnik intensiv genutzt. Sie können (in vitro) auch unabhängig von den funktionell zugehörigen Methylasen operieren und schneiden an absolut definierten Stellen (meist innerhalb der Erkennungssequenz). Einmal geschnittene DNA-Fragmente können durch eine DNA-Ligase wieder kovalent verknüpft werden: EcoRI ist ein so genannter Hexacutter und schneidet statistisch einmal pro 4 6 =4096 Basenpaare. EcoRI spaltet die beiden DNA-Stränge versetzt. Die Spaltprodukte enthalten Einzelstrangbereiche, die eine perfekt-komplementäre Basenpaarungen eingehen können und daher "sticky ends" (dt.: klebrige Enden) genannt werden. Solche sticky ends können besonders effizient ligiert werden. MPM 19 Restriktionsenzyme EcoRI produziert einen 5'-Überhang. Andere Restriktionsenzyme, wie z.b. SphI, produzieren sticky ends mit einem 3' Überhang. Wieder andere Restriktionsenzyme spalten nicht versetzt, sondern ergeben "blunt ends" MPM 20

11 Restriktionsenzyme DNA-Enden, die nach Ligation einen perfekt basengepaarten DNA- Doppelstrang ergeben, werden als kompatibel bezeichnet. Nichtkompatible Enden können nicht oder mit nur extrem geringer Effizienz ligiert werden. Beispiel: SphI-Ende EcoRI-Ende keine Ligation MPM 21 Restriktionsenzyme Zueinander kompatible Enden ergeben sich z.b. durch Restriktionsspaltung identischer Erkennungsstellen mit ein- und demselben Enzym. So kann ein durch EcoRI erzeugtes Ende problemlos mit einem anderen EcoRI-Ende ligiert werden. Kompatible Enden können aber auch durch verschiedene Restriktionsenzyme erzeugt werden, vorausgesetzt, die resultierenden Überhänge sind identisch. Beispiel: Das Ligationsprodukt ist ein "Hybrid" aus BamHI und BglII-Schnittstelle und kann von keinem der Enzyme geschnitten werden. MPM 22

12 MPM 23 Grobes Schema zur Klonierung eines DNA-Fragmentes Um die genomischen Fragmente in den Plasmidvektor klonieren zu können, muss dieser eine geeignete Restriktionsschnittstelle enthalten. MPM 24

13 Klonierungsvektoren Moderne Klonierungsvektoren enthalten eine multiple cloning site (MCS) mit unikalen Schnittstellen für eine Reihe verschiedener Restriktionsenzyme. Die zu klonierenden Genabschnitte können als Restriktionsfragmente in die MCS eingesetzt werden. MPM 25 Grobes Schema zur Klonierung eines DNA-Fragmentes MPM 26

14 Ungerichtete Klonierung Vektor wird mit einem Restriktionsenzym linearisiert, beide Enden des Inserts sind zu beiden Enden des Vektors kompatibel. MPM 27 MPM 28

15 Ungerichtete Klonierung Ungerichtete Klonierung: Die Ligationsreaktion ergibt drei Sorten von Produkten. Nur zirkulär geschlossene Plasmide werden repliziert und können Antibiotikaresistente Transformanten ergeben. Bei diesem Verfahren wird die Mehrzahl der Transformanten lediglich religierten Vektor ohne Insert enthalten (Intramolekulare Reaktion!). MPM 29 Grobes Schema zur Klonierung eines DNA-Fragmentes Frage: wie erreicht man, dass die Bakterien nur Plasmide mit Insert, aber keine "leeren" Vektoren vermehren? MPM 30

16 Restriktionsspaltung Restriktionsenzyme hydrolysieren die Phosphodiesterbindung zwischen zwei Nukleotiden eines DNA-Stranges so, dass die Phosphatgruppe am 5' Ende verbleibt. MPM 31 Ligation erfordert 5ʻ-Phosphat DNA-Ligase verknüpft eine 5' Phosphat-Gruppe und eine 3' OH-Gruppe zu einer Phoshodiesterbindung. Wird die Phosphatgruppe zuvor entfernt, ist eine Ligation unmöglich. MPM 32

17 Vektor-Dephosphorylierung In den linearisierten, dephosphorylierten Vektor wird später das Insert ligiert. Zuvor muss aber die zuvor zugesetzte Phosphatase wieder entfernt werden. MPM 33 Ungerichtete Klonierung Vektor: linearisiert & dephosphoryliert Ligation ergibt 3 Produkte Zirkuläres Plasmid mit Insert. Es bleiben nach Ligation zwei Einzelstrangbrüche, die nach Transformation durch bakterielle Enzyme repariert werden können. Dieses Ligationsprodukt wird daher effizient propagiert. Insert-Multimere (ohne Ori und Resistenz) Insert mit EcoRI-Überhängen und 5' Phosphatgruppen Nicht-ligierter, linearer Restvektor. Kann nicht propagiert werden. MPM 34

18 Gerichtete Klonierung Vektor wird mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten MPM 35 Gerichtete Klonierung Überhängen MPM 36

19 Klonierungsstrategien Die Klonierungsstrategien werden darauf optimiert, dass ein möglichst hoher Prozentsatz der Transformanten solche Vektoren propagieren, die auch ein Insert enthalten. Ausgangspunkte sind: ein Antibiotika-sensitiver Bakterienstamm, Plasmid mit Antibiotikaresistenz und Replikationsursprung. Ausgenutzt wird der Effekt, dass ein zirkulär-geschlossenes Plasmid die Bakterien fach effizienter transformiert als ein lineares. Isolierte Plasmide, die den gewünschten Genabschnitt enthalten, werden als "positive Klone " bezeichnet. Sie können unter den Transformanten durch eine Reihe von Methoden, wie z.b. Restriktionsanalyse und Koloniehybridisierung, identifiziert werden. Finale Analyse ist die Bestimmung der Sequenz des Genabschnitts. MPM 37 Restriktionsanalyse MPM 38

20 Restriktionsanalyse MPM 39 Restriktionsanalyse Analytischer Restriktionsverdau: Auf den Randbahnen sind DNA-Marker zu sehen. Dazwischen die mir BstNI verdauten Plasmide MPM 40

21 DNA-Sequenzierung Basiert auf denaturierender Polyacrylamid-Elektrophorese (in Ggw. von 5 M Harnstoff), mit der selbst DNA-Fragmente mit einer Größendifferenz von nur einem Nukleotid sicher voneinander getrennt werden können. MPM 41 DNA-Sequenzierung Beim Sanger Verfahren wird durch DNA-Polymerase ein komplementärer Strang entlang eines einzelsträngigen Matrizenstrangs synthetisiert. Die Synthese beginnt an einem fixen Startpunkt, wird jedoch nicht vollendet. Es gibt vier Ansätze, bei denen das zuletzt eingebaute Nukleotid entweder ein A, C, G oder T ist. Die neusynthetisierten Stränge werden durch Einbau eines radioaktiven Nukleotids und Autoradiographie nachgewiesen. MPM 42

22 DNA-Sequenzierung MPM 43 MPM 44

23 DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzierung nach Sanger: Wie wird der Startpunkt der Synthese exakt definiert? Wie wird erreicht, dass die Synthese jeweils gezielt nach Einbau von A, C, G oder T abgebrochen wird? MPM 45 Startpunkt der Synthese: Primer MPM 46

24 DNA-Polymerase-Reaktion...DNA-Polymerase in Aktion MPM 47 Abbruch der Polymerasereaktion Dideoxyribonukleoside-5 -triphosphat Nach Einbau eines Dideoxyribonucleotids (ddntp) kann das 3' Ende nicht weiter verlängert werden. Die Synthesereaktion ist terminiert. Die vier Sequenzier- Reaktionen enthalten entsprechend eine jeweils geringe Konzentration von ddatp, ddctp, ddgtp bzw. ddttp. MPM 48

25 DNA-Sequenzierung MPM 49 DNA-Sequenzierung MPM 50

26 DNA-Sequenzierung Bei der ursprünglichen Sangermethode wird der neusynthetisierte Strang über ein radioaktives Nukleotid markiert. Moderne, automatisierte Verfahren nutzen Fluoreszenz-markierte ddntp. Dabei tragen dda, ddc, ddg und ddt jeweils verschiedenfarbige Fluorophore, die in einem Ansatz parallel nachgewiesen werden können. Die ursprünglich vier Sequenzier-Reaktionen können daher im selben Ansatz durchgeführt und analysiert werden. MPM 51 DNA-Sequenz-Chromatogram MPM 52

27 Wie lässt sich ein spezifisches Gen/Genprodukt molekular analysieren? Problem: ein Genom enthält eine praktisch unüberschaubare Menge an genetischer Information. Idealerweise sollte das Genom zur Analyse in "handliche" DNA- Abschnitte zerlegt, die einzelnen Abschnitte isoliert und jeder einzelne Abschnitt als reine Population vermehrt werden. Dafür stehen 2 gängige Methoden zur Verfügung: 1. Das Klonieren des gesuchten DNA- Abschnitts. 2. Die Polymerasekettenreaktion: hierfür wird allerdings Sequenzinformation vom zu analysierenden Gen benötigt. MPM 53 Polymerasekettenreaktion (Engl.: polymerase chain reaction, PCR) MPM 54

28 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) MPM 55 DNA-Polymerase Bezeichnung Organismus Biochemische Funktion Fehler a Mutationen b T opt Thermoresistant Zeit/kb DNA-Polymerase I E. coli Klenow-Fragment E. coli Proteaseverdau von Pol I DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease 5-3 -Exonuclease DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease 9* % % 37 C 20 min 75 C komplett inaktiviert 37 C 20 min 75 C komplett inaktiviert Taq-Polymerase Thermus aquaticus Pfu-Polymerase Pyrococcus furiosus DNA-Polymerase 5-3 -Exonuclease keine 3-5 -Exo. DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease 2,28* ,6% 2,8*10-6 5,6% C T 1/2 (97.5 C) = 9 min 72 C T 1/2 (95 C) 11 h 0,5-1 min/ kb 1-2 min/kb DeepVent-Polymerase Pyrococcus species GB-D DNA-Polymerase 3-5 -Exonuclease 2,7*10-6 5,4% 75 C T 1/2 (95 C) = 23 h T 1/2 (100 C) = 8 h a, Fehlerhäufigkeit pro Base pro effektivem Zyklus b, Prozentuale Häufigkeit von Mutationen bei der Amplifikation von 1 kb für 20 effektive Zyklen MPM 56

29 Primer-Design für die PCR Matrizen-DNA: MPM 57 Primer-Design für die PCR Matrizen-DNA: MPM 58

30 Primer-Design für die PCR Matrizen-DNA: MPM 59 Primer-Design für die PCR 5 Primer MPM 60

31 Primer-Design für die PCR 5 Primer MPM 61 Primer-Design für die PCR 5 Primer MPM 62

32 Primer-Design für die PCR 3 Primer MPM 63 Primer-Design für die PCR 3 Primer MPM 64

33 Primer-Design für die PCR Matrizen-DNA: 5 Primer: 3 Primer: Wie lang müssen Primer sein? MPM 65 Wie lang müssen Primer sein? Stabilität des Primer-Matrizenstrang-Hybrids Faustregel: ( ) + 2 ( n A + n T ) T m = 4 n C + n G Beispiel: GGATCC: T m = = 20 C GAATTC: T m = = 16 C Der T m des Primers sollte mindestens 5-10 C über der Annealingtemperatur sein. % Annealed 99% 90% ΔT=10 C ΔT=5 C MPM 66

34 Wie lang müssen Primer sein? Spezifität des Primers Wie häufig bindet mein Primer statistisch an die Matrizen-DNA? Länge Häufigkeit in zufälliger DNA (1:4 n ) Bindestellen im E. coli Genom bp Bindestellen im Genom des Menschen bp T m (bei 50% GC-Gehalt) 4 1: : :1,68*10 7 0, :4,29*10 9 0,001 0, :1,10* , :2,81* MPM 67 PCR-Anwendungen (einige) PCR-Anwendungen: schnelle Alternative zum Klonieren Einführung von Restriktionsschnittstellen in DNA-Fragmente Analytik: Nachweis geringster Mengen von spezifischen DNA-Molekülen MPM 68

35 PCR-Anwendungen: Schnelles Klonieren Klonierung PCR-Klonierung? Transformation in E. coli Transformation in E. coli Selektion auf Antibiotikaresistenz Selektion auf Antibiotikaresistenz Genbibliothek mit Klone 1 Klon ausreichend Restriktionsanalyse Screening auf gewünschtes Gen MPM 69 Einführung von Restriktionsschnittstellen bei PCR EcoRI-Stelle BamHI-Stelle PCR-Zyklen EcoRI-Stelle BamHI-Stelle Verdau mit EcoRI und BamHI MPM 70

36 Analytik: Realtime-PCR 5-3 -Exonucleaseaktivität MPM 71 Analytik: Realtime-PCR MPM 72

37 Rekombinante Proteinexpression Pro- oder eukaryotische Zellen werden so umprogrammiert, dass sie ein Protein (Proteine) der Wahl (in möglichst großen Mengen) produzieren. MPM 73 Rekombinante Proteinexpression Analyse der Proteinzusammensetzung verschiedener Bakterienstämme durch SDS-Gelelektrophorese und Anfärbung der Banden durch Coomassie: 1: Ausgangsstamm 2-7: Stämme, die verschiedene rekombinante Proteine (*) produzieren. * * * * * * MPM 74

38 Rekombinante Proteinexpression Zur rekombinanten Proteinexpression in E. coli wird der zu exprimierende ORF in ein spezielles Expressionsplasmid kloniert, das folgende Elemente enthält: MPM 75 Anwendungen der rekombinanten Proteinexpression Forschung: funktionelle Untersuchungen an Proteinen. Beispiele für kommerzielle Anwendungen: Produktion von Hepatitis B- Impfstoff, von Peptidhormonen (Insulin, Erythropoietin, Wachstumshormon, Interferon) oder Enzymen. MPM 76