Eine Arbeitsgemeinschaft der Verlage UTB 8449

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2 UTB 8449 Eine Arbeitsgemeinschaft der Verlage Böhlau Verlag Köln Weimar Wien Verlag Barbara Budrich Opladen Farmington Hills facultas.wuv Wien Wilhelm Fink München A. Francke Verlag Tübingen und Basel Haupt Verlag Bern Stuttgart Wien Julius Klinkhardt Verlagsbuchhandlung Bad Heilbrunn Lucius & Lucius Verlagsgesellschaft Stuttgart Mohr Siebeck Tübingen Nomos Verlagsgesellschaft Baden-Baden Orell Füssli Verlag Zürich Ernst Reinhardt Verlag München Basel Ferdinand Schöningh Paderborn München Wien Zürich Eugen Ulmer Verlag Stuttgart UVK Verlagsgesellschaft Konstanz Vandenhoeck & Ruprecht Göttingen Oakville vdf Hochschulverlag AG an der ETH Zürich

3 Thomas Reinard Molekularbiologische Methoden 127 Abbildungen 15 Maps 41 Tabellen Verlag Eugen Ulmer Stuttgart

4 4 Impressum Thomas Reinard, wurde 1963 in Leverkusen geboren und studierte nach dem Abitur 1982 an der Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Biologie. Das Thema seiner Dissertation war die Charakterisierung von Auxin-bindenden Proteinen und wurde am Institut für Genetik und einem längerem Aufenthalt an der University of North Carolina at Chapel Hill durchgeführt. Anschließend wechselte er an das Institut für Pflanzengenetik, Abt. II, der Leibniz Universität Hannover ( wo er als Akademischer Rat arbeitet. Die von ihm geleitete Arbeitsgruppe Molekulare Biochemie beschäftigt sich mit der Herstellung pharmazeutisch relevanter Proteine in Pflanzen sowie mit der Wirkung von Auxinen. Er bietet in den Studiengängen Life Science, Pflanzenbiotechnologie und Biologie eigenverantwortlich Lehrveranstaltungen in den Fächern Molekularbiologie und Bioinformatik an. Er ist einer der Autoren der Dechema-Studie Biotechnologie 2020 ( Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikationen in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. ISBN (UTB) ISBN (Ulmer) Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen Eugen Ulmer KG Wollgrasweg 41, Stuttgart (Hohenheim) Internet: Lektorat: Alessandra Kreibaum Herstellung: Jürgen Sprenzel Umschlagentwurf, Innenlayout und Satz: Atelier Reichert, Stuttgart Druck und Bindung: Egedsa, Sabadell, Spanien Printed in Spain ISBN (UTB-Bestellnummer)

5 5 Inhaltsverzeichnis Vorwort 7 1 Das Leben und seine Bestandteile Der Aufbau von DNA und RNA Der genetische Code Die Gene Die Proteine Die Zelle 27 2 Grundlagen der Arbeit im Labor Wasser Messung des ph-wertes Puffer Waagen Mikropipetten Gefäße im Labor Zentrifugen Mischen und Konzentrieren Konzentrieren Pufferwechsel Proben-Lagerung Steriles Arbeiten Die kleinen Freunde Pflege und Aufzucht von Escherichia coli Der Aufschluss von Geweben 50 3 Aufreinigung von Nukleinsäuren Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen Extraktion von Nukleinsäuren Die weitere Aufreinigung der DNA Einige ausgewählte DNA-Aufreinigungsmethoden Die Isolation von RNA Übersicht über den Einsatz von Kits Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren Quantifizierung von Nukleinsäuren 75 4 Polymerase Kettenreaktion Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion Die Komponenten der PCR Geräte für die PCR Die Standard-PCR Ausgewählte PCR-Methoden Anwendungen der PCR Optimierung der PCR-Reaktion Klonieren für Einsteiger Restriktionsenzyme Ligation Dephosphorylierung Die Transformation von E. coli Der Weg zum klonierten Gen Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor Ligase-unabhängige Klonierungssysteme Wenn es mal nicht klappt Vektoren Plasmide Klonierungsplasmide Rekombinase-basierte Klonierung Expressionsplasmide Reportergene Phagen Phagemide Shuttle-Vektoren Künstliche Chromosomen: BACs, PACs und YACs Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem 149

6 6 Inhaltsverzeichnis 6.11 Die Transformation von Pflanzen Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen Elektrophorese von Nukleinsäuren Agarose-Gelelektrophorese von DNA Die Detektion der DNA im Gel Präparative Agarosegele Auftrennen von RNA im Agarosegel Fehlersuche bei der Agarose- Gelelektrophorese Proteinaufreinigung Homogenisation Extraktion von Proteinen Dialyse und Konzentrierung Weitere Aufreinigungsschritte Quantifizierung von Proteinen Aufreinigungsverfahren für getaggte Proteine aus E. coli Gelelektrophorese von Proteinen Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Die denaturierende SDS-PAGE Das Färben der Gele Weitere Elektrophoreseverfahren für Proteine Western Blotting Wenn es mal nicht klappt Immunbiochemische Methoden Antikörper Prinzipien immunbiochemischer Verfahren Spezifische und unspezifische Bindungen Immunbiochemische Verfahren ELISA Immunfärbung nach Western Blot Immunoaffinitätschromato graphie Weitere Antikörper-basierte Methoden Wenn es mal nicht klappt Molekularbiologie für Fortgeschrittene DNA-Sequenzierung Bioinformatische Sequenzanalyse Der Einsatz der Bioinformatik für die Klonierung von DNA Vollständige Sequenzen durch 3 RACE-PCR und 5 RACE-PCR Stammsammlungen Identifizierung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung DNA-Chips oder Microarrays Veränderung von Nukleinsäuren Synthetische Gene 260 Anhang A1 Sicherheit im Labor 262 A2 Die 10 goldenen Laborregeln 263 A3 Das Laborbuch und die finale Arbeit 264 Verzeichnis der Maps, Protokolle, E-Docs, Tabellen und Abbildungen 266 Abkürzungsverzeichnis 268 Quellenverzeichnis 268 Register 269 Alle E-Docs finden Sie im Internet unter