DNA-KLONIERUNG.

Transkript

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4 DNA-KLONIERUNG

5 DNA- KLONIERUNG: Vervielvältigung eines DNA-Moleküls In vitro - PCR In vivo in unterschiedlichen Wirtszellen

6 POLYMERASE- KETTENREAKTION (Polymerase Chain Reaction, PCR)

7 PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung (Amplifizierung) von Nukleinsäuren Erfinder: Kary Mullis (1985) PCR eröffnet in fast allen Bereichen der Naturwissenschaft zahlreiche neue Möglichkeiten Nobelpreis für Mullis in 1993

8 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Möglichkeit ein Stück DNA (bis auf 40 kb) zu vervielfältigen. Mit dieser Methode lassen sich, mit Hilfe einer hitzestabilen Variante des Enzyms DNA-Polymerase, kurze DNA-Abschnitte vervielfältigen, wobei nur sehr wenig Ausgangsmaterial benötigt wird. Es werden nur die Moleküle verwendet die auch bei der Replikation teilnehmen.

9 Taq-POLYMERASE Thermus aquaticus DNA-Polymerase Taq Taq-Polymerase wird bei 95 C nicht zerstört! Taq-Polymerase funktioniert bei 72 C am besten Die Taq-Polymerase ist eine DNA-Polymerase Durch diese thermostabile Polymerase wurde die Technik im Alltag verwendbar Heute sind auch eine Reihe von rekombinanten Enzymen erhältlich

10 Taq-POLYMERASE Die Taq-Polymerase wurde aus dem in heiβen Quellen lebenden thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen.

11 Die grundlegenden Komponente NUKLEOSID-TRIPHOSPHATE (dntp-s: datp, dgtp, dttp, dctp): die Bausteine für den neuen DNA Strang TEMPLATE: zu amplifizierende DNA, die originale DNA, die man vervielfältigen möchte PRIMER: einzelsträngige DNAs mit einer Länge von Nukleotiden (Oligonukleotide). Thermostabile DNA-POLYMERASE katalysiert die Synthese vom neuen DNA-Strang Enzym-Cofaktor: Mg 2+ (MgCl 2 ) Puffer: Erhaltung des ph-wertes, Salzkonzentration

12 TEMPLATE Eine kleine Menge der DNA-Probe genügt. Rein theoretisch gesehen genügt auch nur ein DNA- Molekül. Die untersuchte Sequenz muss nicht bekannt sein, nur zwei kurze Abschnitte an beiden Enden. Als Template kommen zb. die folgenden Stoffe in Frage: Geronnenes Blut / frisches Blut Haare mit einer Haarwurzel Nagelsplitter Zellen, die an einer Zahnbürste haften

13 PRIMER Primer sind solche kurze Sequenzen die mit beiden Enden der zu vervielfachenden DNA komplementär sind; Ihre 3 Enden sind sich gegenüber. Forward Primer Reverse Primer Primer müssen bei gleicher Temperatur schmelzen (Schmelztemperatur hängt vom GC-Inhalt ab) Primer müssen im grossen Überfluss vorhanden sein

14 PCR-Gerät Schutzhaube Heizblöcke Steuerungseinheit PCR findet in einem Gerät, das THERMO CYCLER genannt wird, statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die Reaktionsröhrchen in kürzester Zeit auf die angegebene Temperatur.

15 Die drei Hauptschritte des PCR-Zyklus DENATURATION - Schmelzen bei ca. 94 C : Zuerst wird die doppelsträngige DNA auf C erhitzt, um die Stränge voneinander zu trennen (die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen brechen auf) und um alle enzymatische Reaktionen stillzulegen (z. B. die bei dem letzten Schritt vom vorherigen Zyklus aktiven Enzyme). ANNEALING - Anlagerung - Primerhybridisierung bei ca C : Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer, die den Start- und Endpunkt des zu vervielfältigenden DNA- Abschnitts bestimmen, sich an die einzelnen DNA-Stränge anlagern können. Diese Primer sind zu den Enden des DNA-Abschnitts komplementär und werden künstlich hergestellt. EXTENSION Elongation - Verlängerung bei ca. 72 C : Schliesslich ergänzt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden (dntps). Sie beginnt am 3 -Ende des Primers und folgt den DNA-Strang. Diesen PCR-Zyklus lässt man 25- bis 50-mal ablaufen.

16 ZYKLUS zu vermehrender DNA-Abschnitt Denaturierung (T>90 C) Annealing (55 65 C) DNA-Synthese (72 C)

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18 EXPONENTIELLER ANSTIEG DER GEWÜNSCHTEN DNA N N = N 0 * 2 n N = Zahl der amplifizierten Moleküle N 0 = Zahl der Startmoleküle n = Zahl der Zyklen N 0 n

19 N Mathematische Beschreibung der PCR N 0 praktisch: n theoretisch: 20 Zyklen: 1,048, Zyklen: 1,073,741,824 Plateau-Phase Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA-Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung

20 Vor der Entdeckung der Taq-Polymerase Man musste die nicht hitzestabile Polymerase in allen Zyklen wieder zugeben. und heutzutage

21 BESTÄTIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MIT GELELEKTROPHORESE

22 AGAROSE GELELEKTROPHORESE - Agarose Gelelektrophorese ist die Methode für Separation von DNA- Fragmenten anhand der Länge der Molekülen - DNA-Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern Sie in einem elektrischen Feld von der Katode in die Richtung der Anode - Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von mehreren Faktoren: - die Konzentration des Gels, die den Porendurchmesser determiniert - die Größe der DNA-Molekülen - die Konformation der DNA- Molekülen - die Zusammensetzung der Elektrolytlösung - die elektrische Feldstärke

23 AGAROSE GELELEKTROPHORESE - die DNA-Fragmente werden nach Ethidiumbromid-Färbung im UV-Licht sichtbar gemacht (EtBr-gefärbte DNA Banden fluoreszieren im UV-Licht) - die Größe von beliebigen Fragmenten kann durch Kalibration mit DNAs von bekannten Größe (sogenannte Marker-DNAs) bestimmt werden - Getrennte DNAs können aus dem Gel für Sequenzierung oder Klonierung isoliert werden.

24 OPTIMIERUNG DES PCR-PROTOCOLS Kritische PCR-Parameter: Konzentration der DNA-Template Länge, Konzentration und Schmelzpunkt der Primer Konzentration freier Nukleotiden Konzentration divalenter Kationen (meistens Mg 2+ ) Art und Konzentration der Polymerase Reaktionsbedingungen (PCR-Programm)

25 PRIMERPLANUNG PRIMERLÄNGE SCHMELZPUNKT (T M ) SPEZIFIZITÄT KOMPLEMENTÄRE PRIMERSEQUENZEN G/C-INHALT SEQUENZ AM 3 -ENDE : Richtung der DNA-Synthese

26 SCHMELZPUNKT, (T M ) PRIMERPLANUNG DEN SCHMELZPUNKT DER PRIMER KÖNNEN WIR EINFACH BESTIMMEN: #: DIE ANZAHL DER ENTSPRECHENDEN BASE IN DEM PRIMER T m = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) C ANNEALING MUSS ZIRKA 5 C NIEDRIGER ALS T M sein BEIDE PRIMER MÜSSEN ÄHNLICHE T M -WERTE HABEN

27 Medizinische Nutzung von PCR: Untersuchung auf erbbare Mutationen Diagnose von viralen Infektionen, z. B. Erkennung von HIV, HPV, EBV, CMV, Herpesvirus, Rotavirus, Calicivirus Diagnose von bakteriellen Infektionen ohne eine Zellkultur zu benötigen, z.b. Erkennung von TBC (Mycobacterium tuberculosis ), Syphilis (Treponema pallidum), Lepra (Mycobacterium leprae ), Chlamydia (Chlamydia trachomatis ) Diagnose von Erbkrankheiten (Detektion von Genmutationen durch Amplifikation, Sequenzierung), z.b. zystische Fibrose, Brustkrebs, Retinoblastom Pränatale Diagnostik: Proben aus der amniotischen Flüssigkeit Geschlechtsbestimmung Diagnose von vererbbaren Krankheiten durch die Detektion der verursachenden Mutationen

28 ANWENDUGEN DER PCR GERICHTSMEDIZIN

29 GERICHTSMEDIZIN - DNA-Fingerabdruck-Analyse - STR (Short Tandem Repeats): - Die 7-40-fache Wiederholung von 2-7 Basen - VNTR (Variable Number of Tandem Repeats): - Die Anzahl der Wiederholungen ist von Mensch zu Mensch unterschiedlich, was eine sichere Identifizierung ermöglicht - Das FBI verwendet 13 polymorphische Loci. Anhand dieser Loci kann jeder Mensch durch seine DNA identifiziert werden.

30 FBI s STR LOCI

31 VNTR Analyse: Die STR-s werden mit PCR vervielfacht und auf einem Gel sichtbar gemacht

32 DNA-Fingerabdruck Analyse in der Gerichtsmedizin - drei untersuchte VNTR- Loci - DNA von drei Verdächtigen + DNA- Probe des Täters vom Tatort - multiplex PCR mit 6 Primern - 6 Fragmente von allen Proben - die Muster der drei Verdächtigen sind unterschiedlich - das Muster der Probe B ist mit dem Muster der Probe F identisch

33 Schwächen der PCR Fehler der Taq-Polymerase: Es besitzt die Fähigkeit des proof reading nicht. Es macht alle 2 x 10 4 Basenpaare einen Fehler. Die neuen rekombinanten Polymerasen sind besser. Kontamination (mit anderer DNA) Wenn der Primer sich am Anfang an eine schlechte Stelle bindet, kann es vorkommen, dass nicht das gewünschte Fragment vervielfacht wird.

34 REKOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE DNA Fragmente aus verschiedenen Quellen können kovalent gekoppelt werden

35 REKOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE DNA Fragmente aus verschiedenen Quellen können kovalent gekoppelt werden

36 RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN Enzyme, die DNA schneiden können

37 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN - Manche Bakterienstämme sind gegen Infektion mit Bakteriophagen immun, sie produzieren Enzyme, die die Phagen-DNA abbaut, noch bevor sie sich replizieren kann (Abwehrmechanismus). - Die Entdeckung von Restriktions-Modifikations Systeme in Bakterien führte zur Entwicklung von gezielten, kontrollierten und reproduzierbaren in vitro DNA-Spaltung und Ligation. - Das ist die Grundstrategie der DNA-Klonierung. - Das Restriktions-Modifikations-System beruht sich auf zwei Enzyme: - 1. Restriktionsendonuklease - 2. DNA-Methylase

38 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 1. Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen, Restriktasen, REs): erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden die doppelsträngige DNA innerhalb oder in der Nähe der Erkennungssequenz. - Restriktion deutet die Fähigkeit von Bakterien zur Degradierung fremder DNA nach Infektion von Bakteriophagen an. (Die Wirtszelle erzeugt restriktive Umständen für die Bakteriophagen) 2. DNA-Methylase modifiziert die Bakterien-DNA mit Methylgruppen innerhalb der Erkennungssequenz von eigenen Restriktasen.

39 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN - Restriktionsendonukleasen erkennen DNA-Sequenzen von vier bis acht Basenpaaren (Restriktionsstelle). - die Erkennungssequenzen sind sogenannte Palindrome: DNA- Sequenzen, die gleich sind, wenn der eine Strang von links nach rechts und der andere von rechts nach links gelesen wird - Viele Restriktionsenzyme bilden überhängende komplementäre einzelsträngige DNAs an den Enden der Restriktionsfragmenten. Die werden auch als klebrige Enden bezeichnet. Ligase kann mit hoher Effizienz DNAs mit homologen klebrigen Enden binden. 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5

40 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN - Eine zweite Gruppe von Restriktasen produziert gerade (oder glatte) Enden. Diese Enden ohne komplementäre überstehende Enden können nur schwer von Ligase gekoppelt werden. Die haben aber den Vorteil, dass sie alle anderen DNAs mit glatten Enden binden können.

41 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN EcoRI spaltet die doppelsträngige DNA innerhalb der Erkennungssequenz

42 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 4 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 4 4 = 256 Basenpaare Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 6 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 4 6 = 4096 Basenpaare Ein Enzym mit einer Erkennungssequenz von 8 Basenpaaren schneidet durchschnittlich alle 4 8 = Basenpaare

43 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN Enzym Quelle Erkennungsstelle Durchschnittliche Fragmentgrösse

44 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN Unterschied bei der Verdauung zirkulärer und linearer DNA

45 AGAROSE GELELEKTROPHORESE Marker DNA Trennung von DNA-Molekülen anhand Molekulargewicht

46 RESTRIKTIONSKARTIERUNG Unabhängige und Parallelverdauung mit zwei oder mehreren Restriktionsendonukleasen wird gemacht um die Position der Schnittstellen zu bestimmen, eine Restriktionskarte zusammenzustellen RE1 RE2 RE1+RE2

47 RFLP Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus Unterschiede in den DNASequenzen zwischen Individien können als genetische Marker in menschlicher DNA genutzt werden Erste Markergeneration (1986): basieren auf Unterschieden in Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

48 RFLP Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus Die Länge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht. Verwendung: Identifizierung eines Individuums Identifizierung rezessiv vererbter Krankheiten, pränatale Diagnose von Erbkrankheiten.

49 RFLP Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus Identifizierung rezessiv vererbter Krankheiten, pränatale Diagnose von Erbkrankheiten. Sichelzellanämie

50 DNA-KLONIERUNG - DNA-Klonierung: eine Methode, bei der man eine beliebige DNA- Sequenz, z. B. ein Gen, in einen Vektor z. B. ein Plasmid integriert und dann es in lebendigen Zellen amplifiziert - Amplifikation von einzelnen DNA Molekülen in vitro - mit PCR - Amplifikation von einzelnen DNA Molekülen in vivo (in Zellen) - Notwendige Komponente der DNA-Klonierung: DNA-Fragment mit kompatibelen Restriktasen linealisierte Vektor- DNA DNA-Ligase Kompetente Wirtszellen

51 DNA-KLONIERUNG: WIRTSZELLE - eine Wirtszelle wird mit dem Konstrukt aus dem Vektor und der integrierten, zu untersuchenden DNA transformiert und kann dann untersucht werden - die typischen Wirte in molekularbiologischen Laboratorien sind Stämme des Bakteriums Escherichia coli - für molekulare Klonierung werden nicht pathogene Stämme von E. coli benutzt - in solchen Stämmen kann fremde DNA in enormen Mengen amplifiziert werden, die fremde DNA bleibt stabil - die Stämme sind Mutanten für bestimmte Gene, die für Rekombination und das Restriktions- Modifikationssystem verantwortlich sind - E. coli hat die Vorteilen, dass es schnell und einfach kultiviert werden kann (eine Zellteilung dauert 20 Minuten) und genetisch gut charakterisiert ist - neben E. coli, viele andere prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen sind verwendet

52 DNA-KLONIERUNG: VEKTOREN - In vitro hergestellte DNA kann in die Wirtszellen mithilfe von Vektoren eingebracht und vermehrt werden - Vektor-DNAs stammen von prokaryotischen oder eukaryotischen Plasmiden, Viren und Transposonen - als ein Vektor in die Wirtszelle gelangen ist (durch Transformation oder Transfektion) - integriert es sich ins Genom, oder - verhält es sich als individuelles Replikon in der Zelle (Replikationsstartstelle) - Vektor DNAs sind am meisten in vitro modifiziert und enthalten die folgenden Komponenten: - Selektionsmarkergen (z.b. Gen für Antibiotika-Resistenz) - Unikale Restriktionsstelle(n) - viele Vektoren wurden für speziellen Zwecken entwickelt: z.b. Expressionsvektoren ermöglichen die Produktion von Proteinen anhand der klonierten DNA

53 NATÜRLICHE PLASMIDE - Natürliche Plasmide sind kleine ringförmge DNA-Moleküle - sie können in hoher Kopienzahl in einem Bakterium vorkommen - sie werden unabhängig von dem bakteriellen Chromosom repliziert (Replikationsursprung, ori) - sie tragen oft Gene für Antibiotikaresistenz

54 PLASMIDVEKTOREN - künstliche Plasmide werden als Plasmidvektoren benutzt - sie tragen Gene für Antibiotikaresistenz - Selektion - ori: Replikationsursprung, das Plasmid kann in E. coli vermehrt werden - MKS: multiple Klonierungsstelle mit einer Reihe unikalen Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen

55 Klonierung von Fremd-DNA in - Die Vektor-DNA wird mit einem Restriktionsenzym linearisiert - die Ziel-DNA, die als Insert in den Vektor (Plasmid) integriert werden soll, wird mit dem gleichen Enzym geschnitten - komplementäre Enden entstehen an Vektor- und Ziel-DNA (überstehende Einzelstränge) - so ist es nun möglich, den Vektor und das Ziel- DNA-Stück miteinander zu verbinden (Ligase) einen Plasmidvektor

56 DNA-KLONIERUNG: LIGATION - DNA Ligase: ein Enzym, das DNA- Moleküle zwischen einem 5 -Phosphat- Ende und einem 3 -OH-Ende miteinander verbinden kann - DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können diese Basenpaarung eingehen - die Enden werden als kohäsiv oder klebrig bezeichnet, über die können DNAs durch die DNA-Ligase fest verbunden werden - die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken - die Ligation wird bei 10 bis 15ºC durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym (Ligase) noch arbeitet.

57 DNA-KLONIERUNG: TRANSFORMATION - Transformation im Zusammenhang mit rekombinanter DNA: das Einbringen von DNA in eine Zelle - das Vektor-Insert-Konstrukt wird in E. coli eingeführt - die meisten Bakterien (auch E. coli) nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang auf - um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen physisch und/oder chemisch behandeln - so wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen - Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetente Zellen - nach der Transformation erfolgt die Selektion von Bakterien, die den Plasmid mit dem Insert enthalten - dafür kann man bei Plasmidvektoren deren Antibiotikaresistenzgene ausnutzen, oder - Vektoren benutzen, die das lacz-gen enthalten (Genprodukt des lacz-gens ist das Enzym ß- Galactosidase, es katalysiert die Hydrolyse des Substrates X-gal wodurch Blaufärbung entsteht)

58 DNA-KLONIERUNG: SELEKTION Selektion der Bakterienzellen mit dem rekombinanten Vektor: Plasmide mit zwei Antibiotikaresistenzgene Plasmide mit dem lacz Gen

59 DNA-KLONIERUNG: SELEKTION Gen von Interesse Rekombinantes Plasmid Verdauung mit Restriktase Ligation Transformation R2 R1 Plasmid Verteilung der Bakterien an der Oberfläche von festem Medium, das Antibiotikum 1 enthält Replika-Platierung auf Platte mit Antibiotikum 2 Isolierung der Antibiotikum 2 sensitiven Kolonien von Meister Platte Nachtsüber Wachsen Isolierung der Plasmid-DNA Meisterplatte Replikaplatte Plasmide mit zwei Antibiotika-Resistenz Genen

60 DNA-KLONIERUNG: SELEKTION Gen von Interesse Rekombinantes Plasmid lacz Verdauung Ligation Transformation R1 Verteilung der Bakterien an der Oberfläche von festem Medium, das Antibiotikum 1 und X-Gal enthält Isolierung der weißen Kolonien Nachtsüber Wachsen Isolierung der Plasmid DNA Weiße Kolonien: keine X-gal Abbau, rekombinantes Plasmid Plasmide mit dem lacz Gen

61 EXPRESSIONSVEKTOREN

62 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE Mithilfe von Bakterien können rekombinante Proteine in grossen Mengen hergestellt werden. Das proteinkodierende Gen muss in einen Expressionsvektor mit induzierbarem bakteriellen Promoter eingebaut werden.

63 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE Rekombinante Proteine werden in grossen Mengen von Bakterien isoliert, z.b. mit Affinitätschromatographie.

64 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE Viele eukaryotische Proteine können in Bakterien nicht produziert werden, weil posttranslationale Modifikationen (welche essentiell für die Proteinfunktion sind) nur in Eukaryoten ablaufen. In solchen Fällen benutzt man eukaryotische Expressionssysteme.

65 MEDICAL APPLICATIONS

66 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit