Versuchsprotokoll Klonierung eines amplifizierten PCR-Fragments. 0 Inhaltsverzeichnis

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1 0 Inhaltsverzeichnis 0 Inhaltsverzeichnis Einleitung Versuch Versuchsteil (PCR und Gel der cdna) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil (Gel des Plasmids) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil und (Extraktion aus Gel und Gel der Restriktion) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil und (Hi-Bind Säule, Konzentrationsverhältnis) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil (Ligation) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil , , und (Herstellung der Bakterienkolonien) Einführung Durchführung Auswertung Versuchsteil (PCR der weißen Kolonien) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil , , (DNA-Minipräps, Konzentration d. Plasmid) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil (Analytisches Gel Minipräp) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil (Restriktion der weißen Kolonie) Einleitung Durchführung Auswertung Versuchsteil (Orientierungsbestimmung durch PCR) Einleitung Durchführung Auswertung Diskussion Seite von 16

2 1 Einleitung Ziel des vorliegenden Versuchs ist es, eine amplifizierte cdna-sequenz in kompetente Zellen zu klonieren. Die Vorgehensweise sei nun nachfolgend kurz skizziert: Eine gp80 cdna-sequenz wird durch eine PCR amplifiziert, an ihren Schnittstellen durch das Restriktionsenzym Pst I geschnitten und dann in das Plasmid puc19 einkloniert. Das Plasmid mit Insert wird dann in zuvor kompetent gemachte Zellen (E. coli xl1blue) transformiert und somit kloniert. Durch eine nachfolgende Lyse der Zellen wird das neue Plasmid aufgereinigt und die Orientierung des Inserts festgestellt. Im nun folgenden Kapitel Versuch ist die detaillierte Vorgehensweise aufgezeigt und die daraus resultierenden Teilschritte mit Ergebnissen und Diskussionen dargestellt. 2 Versuch 2.1 Versuchsteil (PCR und Gel der cdna) Einleitung In diesem Versuchsteil wird die cdna vervielfältigt (amplifiziert) und dann auf ein Gel aufgetragen, um ihre Existenz zu beweisen und die Reinheit zu gewährleisten. Ob es sich um das gesuchte DNA-Stück handelt, kann man an der Größe feststellen, die man anhand des aufgetragenen Standarts VII ungefähr abschätzen kann Durchführung Die Durchführung des Versuchsteils wird wie im Skript Seite vorgenommen. Pipettieransatz: 25µl Hot Start Mix (dntps, Puffer, Taq-Polymerase, Magnesium) 2µl Clus-Hund-F (Forward-Primer) 2µl Clus-Hund-R2 (Reverse-Primer bei 1125bp bis 1138bp) 2µl cdna (20ng) 19µl Wasser 50µl Endvolumen Zum Auftragen des PCR-Produkts werden 5µl PCR-Produkt 5µl Wasser 2µl Autragspuffer 6fach (im Folgenden immer nur AP genannt) aufgetragen. Seite von 16

3 2.1.3 Auswertung Das amplifzierte DNA-Stück ist 785bp lang. Beim nachfolgenden Gelbild sind der Standart VII und der Standart XIV in Geltasche 6 bzw. 13 aufgetragen. Abb. 1: Gel v. PCR der cdna In der Spur 1 ist keine Bande zu erkennen. Dort hat die PCR der cdna nicht funktioniert. Auf Spur 5 ist die Bande nicht so kräftig wie bei den anderen Banden. Hier wurde eine geringere Menge PCR-Produkt aufgetragen. Ist weniger DNA aufgetragen, kann sich auch weniger Ethidiumbromid in die Furchen der DNA einlagern. Somit ist auch die Strahlung unter der UV-Lampe geringer. Die unterschiedlichen Höhen der restlichen Banden sind auf die Benutzung der 2 verschiedenen Reverse-Primer bei der PCR zurückzuführen. Bei Benutztung des Clus-Hund R ist das DNA-Fragment einige Basenpaare kleiner und läuft aus physikalischen Gründen weiter als das größere DNA-Fragment, was durch die Benutzung des Clus-Hund R2 entstanden ist. Vergleicht man die Proben mit den zwei Standarts und mit der berechneten Basenlänge, so kann man sagen, dass es sich hier wirklich um das gewollte DNA-Stück handelt. 2.2 Versuchsteil (Gel des Plasmids) Einleitung In Versuchsteil wird auf das Gel die Restriktionslösung des Plasmids (Vektors) aufgetragen. Auch dieser Schritt dient dazu eine Verunreinigung mit nicht verdautem Vektor zu vermeiden Durchführung Die Durchführung wird, wie im Skript auf Seite 90 beschrieben, vorgenommen. 10µl Restriktionsansatz (verdauter Vektor) Seite von 16

4 2µl AP (6-fach) 12µl Endvolumen Auswertung Abb. 2: Gel des restringierten Vektors Auf dem Gelbild kann man auf der Spur 7 den Standart VII erkennen. Die Spur 1 wurde freigelassen. Alle anderen Banden sind gleich weit gelaufen. Vergleicht man nun die Banden mit dem Standart VII, kann man feststellen, daß die Größe des Vektors, welche man anhand des Gels ablesen kann, mit der bekannten Größe von 2,69kb übereinstimmt. Es handelt sich somit, um den gewollten Vektor. Bei Bande 6 wurde ein ungeschnittenes Plasmid zur Kontrolle aufgetragen. Die Konzentration war jedoch zu gering gewählt, dass man die Bande nicht sehen kann. 2.3 Versuchsteil und (Extraktion aus Gel und Gel der Restriktion) Einleitung Die in den vorherigen Versuchsteilen durchgeführten Gel-Elektrophoresen haben für die Aufreinigung des DNA-Fragment und des Vektors (Plasmids) gedient. Die so aufgereinigten Substanzen müssen nun aus dem Gel ausgelöst werden, um miteinander legiert werden zu können. Das Herauslösen des Inserts und des Plasmids erfolgen durch die sogenannte HiBind-Säule. Nun erfolgt unter Versuchsteil die Restriktion des DNA-Fragments an den Schnittstellen PstI. Nach der Restriktion wird unter Versuchsteil eine erneute Gelelektrophorese durchgeführt, um das geschnittene DNA-Fragement (ab nun als Insert bezeichnet) von dem ungeschnittenen DNA-Fragmenten zu trennen. Seite von 16

5 2.3.2 Durchführung Zur Entfernung der Agarose wird ein Bindepuffer hinzugegeben. Die Menge des Bindepuffers wird über das Gewicht des herausgeschnittenen Gelstücks bestimmt. Das Gelstück wiegt 119,8mg. Somit muss 100mg = 400µl 120mg = 480µl hinzugegeben werden. Für den Restriktionsansatz ist folgendes Pipettierschema angewendet worden: 26µl DNA-Fragment 5µl Puffer H (10-fach) 18µl Wasser 1µl Restriktionsenzym PstI 50µl Endvolumen Die erneute Gelelektrophorese wird mit dem geschnittenen Insert, dem Standart XIV und den ungeschnittenen DNA-Fragmenten (Fragment mit Reverse-Primer R und Reverse-Primer R2) durchgeführt. Die restlichen Schritte können im Skript auf den Seiten nachvollzogen werden Auswertung Das nachfolgende Gel enthält bei Bande 4 das ungeschnittenen DNA-Fragment Reverse- Primer R, bei Bande 5 den Standart XIV, bei Bande 6 das ungeschnittene DNA-Fragment Reverse-Primer R2 und bei Bande 1 meine Probe. Abb. 3: Gel des geschnittenen Inserts Nur bei den Spuren 1 und 3 ist ein klarer Unterschied zwischen ungeschnittenem DNA- Fragment und dem Insert zu erkennen. Die unterschiedlichen Höhen der beiden oberen Seite von 16

6 Banden von Spur 1 und 3 kommen durch den unterschiedlichen PCR-Primer zustande (siehe Versuchsteil ). Die beiden unteren Banden entsprechen dem geschnittenen Insert. Vergleicht man die Banden mit dem Standart kann man feststellen, dass auch die Größe auf das Vorhandensein des Insert spricht. Auf Spur 9 kann man keine Bande feststellen. Hier hat die PCR der DNA erst gar nicht funktioniert. (Hier sei vermerkt, dass auch das PCR-Gel keine Bande gezeigt hat.) 2.4 Versuchsteil und (Hi-Bind Säule, Konzentrationsverhältnis) Einleitung Auch hier wird das geschnittene Insert per HiBind-Säule aus dem Gel extrahiert. Bei Versuchsteil wird eine Gelelektrophorese gemacht, um das Konzentrationsverhältnis zwischen Insert und Vektor zu bestimmen, damit man für die Ligation die geeigneten Stoffmengen einsetzen kann. ( ) Durchführung Die Extraktion wird wie unter 2.4. durchgeführt. Anleitung bitte Skript Seite 93 entnehmen. Das nun extrahierte und geschnittene Insert wird zusammen mit dem Vektor zur Konzentrationsbestimmung in gleicher Menge nebeneinander auf das Gel aufgetragen. Pipettierschema: 3µl Vektor bzw. Insert 7µl Wasser 2µl AP (6-fach) 12µl Endvolumen Auswertung Das nachfolgende Gel zeigt das Ergebnis: 2 1 Abb. 4: Gel zur Bestimmung des Konzentrationsverhältnisses zwischen Insert und Vektor Seite von 16

7 Die Helligkeit der Banden zeigt die Konzentration an. Allerdings ist dabei zu berücksichtigen, dass der Vektor ungefähr 4mal so groß ist wie das Insert. Somit entspricht die gleiche Helligkeit der beiden Banden einem Konzentrationsunterschied von 4:1 (Insert : Vektor). Da man bei der Ligation jedoch genau dieses Verhältnis einsetzen soll, ist eine gleiche Helligkeit arbeitserleichternd. Betrachtet man das Gel so kann man bei Spur 9 und 10 (Pfeil 1 und 2) genau die gleiche Helligkeit feststellen. Die Spur 9 entspricht dem Insert, die Spur 10 dem Vektor. Die ungefähren Größen, die man am Standart XIV ablesen kann, entsprechen den bekannten bzw. errechneten Größen des Inserts bzw. des Vektors. Somit ist die Stoffmenge für die Ligation bestimmt. Nachfolgende Rechnung macht dies noch einmal deutlich: Vektor (ca. 2,69kb) und Insert (ca. 650bp) gleiche Helligkeit der Banden. Konzentration bei der Ligation soll wenigstens im Bezug auf das Insert 3-fach sein. Vektor ist ca. 4mal so groß. Also nimmt man die gleiche Menge und hat somit ein Verhältnis von ca. 4: Versuchsteil (Ligation) Einleitung Bei der nachfolgenden Ligation werden Insert und Vektor vereinigt. Dies kann nur deswegen geschehen, weil beide mit dem gleichen Restriktionsenzym PstI geschnitten wurden. Somit besitzen sie die gleichen sticky ends (überhängende Enden, die die Ligation vereinfachen) und werden somit ligiert Durchführung Die Durchführung wird wie im Skript auf Seite 95 durchgeführt. Das Pipettierschema sieht wie folgt aus: 10µl Plasmid 10µl Insert 2,3µl Ligationspuffer (10-fach) 1µl Ligase 23,3µl Endvolumen Auswertung 1bp entspricht 660g/mol Seite von 16

8 642bp * 660g/mol = g/mol 2690bp *660g/mol = g/mol Die Größe des Vektors ist ca. 4mal so groß. Versuchsprotokoll Insertlänge = 642bp, Vektorlänge = 2690bp = 3332bp (Länge des puc19 mit Insert) 2.6 Versuchsteil , , und (Herstellung der Bakterienkolonien) Einführung Die Bakterien E.coli xl1blue wurden über Nacht in Overnight-Röhrchen in LB-Medium vermehrt. Aus diesem entstandenen Medium wird dann 1ml entnommen und in einem neuen LB-Medium gezüchtet, bis der OD 600 -Wert zwischen 0,5 und 0,7 liegt. Bei diesen Werten ist die Bakterienkultur im besten logarithmischen Wachsen und am geeignesten für die Transformation ( ). Die Transformation des Vektors mit dem Insert in die Bakterienzelle erfolgt durch Calciumchlorid. Die Bakterien werden mit dem Ligationsansatz leicht gemischt und durch die entstandene Permeabilität der Membran durch das Calciumchlorid gelangt das Plasmid mit Insert in die Zellen. Zusätzlich wird auch eine Positivkontrolle durchgeführt. Die genaue Vorgehensweise findet man im Skript auf den Seiten 93, 94 und Durchführung Die Durchführung geschieht laut Skript Seite 93, 94 und 96. Bei Versuchsteil werden 2mal 100µl in CaCl 2 aufgenommen und in ein Greinerröhrchen überführt. Im Versuchsteil wird folgendermaßen vorgegangen: Von der Bakterienkultur mit dem OD 600 -Wert von 0,5 bis 0,7 werden 2mal 1,5ml in Eppis gegeben und bei 4000rpm 2 Minuten zentrifugiert. Das Pellet entspricht den Bakterien mit dem neuen Plasmid. Von dem Ligationsansatz werden 100µl ausplattiert, von der Positivkontrolle (Nummer 3) 90µl und von einer 1:10 verdünnten Positivkontrolle ebenfalls 100µl auf eine Agarplatte mit LB- Medium und Ampicillin ausplattiert Auswertung Ligationansatz: Positivkontrolle: Positivkontrolle (verdünnt): Religation: gewachsen (blaue und weiße Kolonien) nicht gewachsen nicht gewachsen gewachsen Seite von 16

9 Übersicht der gesamten Versuchsgruppe: Was? Gewachsen Nicht gewachsen Religation 3 0 Ligation 7 1 Positivkontrolle Nummer Positivkontrolle Nummer Positivkontrolle Nummer Dass die Kontrollen nicht bzw. nur schlecht gewachsen sind, kann nur auf das nicht Vorhandensein eines Plasmids und somit einer Ampicillinresistenz beruhen. Dies erklärt auch das Wachsen des Ligationsansatzes und der Religation, die beide diese Resistenz besitzen. Warum weisen manche Kolonien eine blaue bzw. keine Färbung auf? Wurde bei der Ligation nur eine Religation vollzogen, also kein Insert eingebaut, so ist das lacz- Gen intakt. Dieses kodiert für die ß-Galactosidase, die das auf den Platten aufgetragene X-Gal enzymatisch abbaut. Das Abbauprodukt erscheint dann blau. Wurde hingegen ein Insert eingebaut, ist das lacz-gen nicht mehr aktiv, da es vom Insert unterbrochen wird. Ein Abbau des X-Gal ist nicht möglich. Diese Kolonien verbleiben weiß. Die Funktion des zusätzlich aufgetragenen IPPD ist die Blockierung des Repressors des lacz-gens. Kann der Repressor nicht am Operator andocken, ist eine Bildung von ß-Galactosidase erst möglich. 2.7 Versuchsteil (PCR der weißen Kolonien) Einleitung Dieser Schritt dient der Kontrolle! Hier entscheidet sich erstmals, ob die weiße Kolonie wirklich ein Plasmid mit Insert trägt. Da diese PCR der weißen Bakterienkolonie allerdings nicht als besonders sicher gilt, werden im Versuchsteil die gleichen Kolonien für die Animpfung von Minipräps genutzt, um das Ergebnis zusätzlich abzusichern Durchführung Die Durchführung wird laut Skript Seite 97 durchgeführt. Änderung des Pipettieransatzes: Seite von 16

10 12,5µl Hot start Mix 10,5µl Wasser mit Bakterien 1µl Reverse Primer 1µl Universal Primer 25µl Endvolumen Versuchsprotokoll Auswertung Theoretisch ist das Amplifikat dieser PCR ca. 746bp groß. Auf die Zahl kommt zustande, wenn man das Insert zwischen den beiden Pst I- Schnittstellen berechnet (ca. 642bp) und das Stück Plasmid zwischen dem Reverse- und Forward- Primer-Praktikum hinzurechnet (104bp). Ist das Insert nicht vorhanden, ist das Amplifikat nur 104bp groß. Abb. 5: PCR der weißen Bakterienkolonie Dies kann man eindeutig an den Spuren 8 und 9 erkennen. Die Spur 9 ist die Positivkontrolle, die das Insert scheinbar gar nicht trägt. Dies lässt sich auch später anhand den Minipräps aufzeigen ( ). Die Spur 8 entspricht der Selbstligation, die hier eindeutig das Insert trägt (Vergleich mit Standart XIV). Meine PCR (Spur 3 bzw. 4)der Selbstligation sowie Positivkontrolle hat nicht funktioniert. Mögliche Gründe sind: 1) Die PCR hat nicht funktioniert. 2) Es wurde eine blaue Bakterienkultur gepickt. Dafür spricht, dass andere Praktikanten andere vermeintlich weiße Kolonien von mir gepickt haben, deren PCR funktioniert hat. Trotzdem kann man auch bei 104bp keine Bande erkennen. Dies kann man sich vielleicht bei der Betrachtung des Gels erklären, da hier vielleicht die 104bp-große Bande schon aus dem Gel gelaufen ist. 2.8 Versuchsteil , , (DNA-Minipräps, Konzentration d. Plasmid) Einleitung Um zu überprüfen, ob die Klonierung funktioniert hat, wird eine weiße Kolonie über Nacht vermehrt ( ). Am nächsten Tag erfolgt dann die DNA-Minipräparation, bei der der vermehrte Plasmid präpariert wird. Dies erfolgt durch eine alkalische Lyse der Bakterienzelle ( ). Seite von 16

11 In dem Versuchsteil wird dann die Optische Dichte des Plasmids zur Konzentrationsbestimmung gemessen, um eine Aussage über die Reinheit des Plasmids zu machen. Dabei wird einmal bei 260nm (DNA) und bei 280nm (Proteine) gemessen und der Quotient gebildet. Dieser sollte ca. 1,7 betragen Durchführung Die Durchführung erfolgt laut Skript Seiten 98 und 99. Änderung bei : Das Pellet wird im vorletzten Schritt in 100µl Wasser aufgenommen und es werden nur 20µl für die Konzentrationsbestimmung eingesetzt Auswertung Gemessene Extinktion: Positivkontrolle Ligationsansatz DNA bei 260nm 0,484 0,325 Proteine bei 280nm 0,278 0,173 Beispiel der Berechnung der Konzentration: 1,0 OD = 50µg/ml 0,1 OD = 5µg/ml Wir haben aber nur 20µl, deswegen: 5µg = 20µl xµg = 1µl x = 5/20 c = 0,25 µg/µl für 1 OD ist c = 2,5µg/µl. Es werden nur die Konzentrationen der Positivkontrolle und des Ligationsansatzes der DNA bestimmt. Positivkontrolle: Ligationsansatz: c = 0,484 * 2,5µg/µl =1,21 µg/µl c = 0,325 * 2,5 µg/µl = 0,8125µg/µl Es sollen im Versuchsteil jedoch 2µg DNA eingesetzt werden, deswegen: Positivkontrolle: Ligationsansatz: 2µg = xµl 2µg = xµl 1,21µg = 1µl 0,8125µg = 1µl x = 1,7µl x = 2,5µl Berechnung des OD-Quotienten: OD-Quotient = 0,484 / 0,278 = 1,74 für die Positivkontrolle OD-Quotient = 0,325 / 0,173 = 1,87 für den Ligationsansatz Seite von 16

12 2.9 Versuchsteil (Analytisches Gel Minipräp) Einleitung Die oben berechnete Menge DNA wird auf dem Gel aufgetragen und somit erneut geprüft, ob das Insert einkloniert wurde Durchführung Die Proben für das Gel wurden folgendermaßen angesetzt: Positivkontrolle: Ligationsansatz: 1,7µl DNA 2,5µl DNA 8,3µl Wasser 7,5µl Wasser 2µl AP (6-fach) 2µl AP (6-fach) 12µl Endvolumen 12µl Endvolumen Auswertung Abb. 6: PCR Minipräp (keine bp angegeben, da kein Standart aufgetragen wurde) Auch hier ist bei dem Ligationsansatz und der Positivkontrolle (Spur 3 bzw. 4) keine Bande zu erkennen. Erklärung siehe Ein weiterer Grund könnte sein, dass sich die Zellen nach das Plasmid nach der Aufreinigung nicht richtig gelöst hat. Ein Beweis bleibt aus. Auf Spur 8 ist die Kontrolle aufgetragen. Betrachtet man Spur 5 (eigene Ligation) und Spur 6 (Positivkontrolle) so stellt man fest, dass die eigene Ligation das Insert beinhaltet. Die Positivkontrolle dagegen ist negativ. Diese Aussage passt zu der Aussage, die unter 2.8. getroffen wurde. Die dicken Banden entsprechen der supercoild (s.c.) Form des Plasmids, die durch ihre Komprimierung am weitesten wandert. Die darüberliegenden Banden sind nicked circled (n.c.) Form. Die lineare Form kann man hier nicht erkennen. Die Banden, die sich auf der Höhe der Geltaschen befinden, können der genomischen DNA entsprechen. Am unteren Rand des Gels kann man die RNA-Bande erkennen. Seite von 16

13 2.10 Versuchsteil (Restriktion der weißen Kolonie) Einleitung Die Restriktion der weißen Kolonie dient der Orientierungsbestimmung. Ab diesem Versuchsteil habe ich die Selbstligation von Karoline eingesetzt Durchführung Durchführung siehe Skript Seite 100. Pipettierschema des Restriktionsansatzes: 8,5µl DNA des Klons 5µl 10-fach Puffer PvuII 35,5µl Wasser 1µl PvuII-Enzym 50µl Endvolumen Danach Auftragung auf Gel mit 2µl AP (6-fach) mit 10 µl verdauter DNA Auswertung Meine Bande Abb. 7: Restriktion der weißen Kolonie Auf Spur 5 befindet sich meine Bande. Sie ist ca. 2,6kb groß. Dies entspricht dem geschnittenen Plasmid. Das herausgeschnitten Insert (plus einige Basen des Plasmids bis zur Schnittstelle PvuII) ist auf dem Gel nicht mehr zu sehen. Es ist aus dem Gel herausgelaufen. Somit ist die Bestimmung der Orientierung anhand dieses Gels nicht möglich. Seite von 16

14 Insert Abb. 8: Skizze des puc 19 mit Insert und der möglichen Schnittstellen des PvuII-Restriktionsenzyms Wenn PvuII auf dem Plasmid schneidet, entsteht die bei der Abb. 7 aufgezeigte Bande. Über die Größe der kleinen Stücke könnte man die Orientierung herausfinden 2.11 Versuchsteil (Orientierungsbestimmung durch PCR) Einleitung Durch die PCR mit unterschiedlichen Primern auf dem Plasmid und dem Insert kann hiermit eine Orientierungsbestimmung gemacht werden Durchführung Die Durchführung erfolgt wie im Skript auf Seite 101 beschrieben. Pipettierschemata: PCR 1 PCR 2 PCR 3 (nochmalige Kontrolle meiner Pos.-Kontrolle) 1µl DNA 1µl DNA 5µl DNA 1µl KB3-Primer 1µl KB3-Primer 1µl Universal-Primer 1µl Reverse-Primer 1µl Forward-Primer 1µl Reverse-Primer 9,5µl Wasser 9,5µl Wasser 5,5µl Wasser 12,5µl Hot Start Mix 12,5µl Hot Start Mix 12,5µl Wasser 25µl Endvolumen 25µl Endvolumen 25µl Endvolumen Auswertung Abb. 9: PCR des Minipräps Auf der Spur 7 befindet sich der Standart XIV. Die Banden auf den Spuren 2, 6, 9, 11 und 12 sind alle gleich weit gelaufen. Es handelt sich hier der Größe nach um unser Plasmid (ca. 1000bp). Seite von 16

15 Bei den Spuren 2, 3 und 4 handelt es sich um meine Proben. Auf Spur 4 wurde noch einmal die Positivkontrolle der vorherigen Versuchsteile aufgetragen. Auch dieses Mal ist keine Bande zu erkennen. Erklärung siehe Auf Spur 2 handelt es sich um die PCR 1 (siehe Durchführung), bei Spur 3 um die PCR 2. Das Ergebnis ist somit eindeutig. Das Insert wurde richtigrum eingebaut! Die Zeichnungen werden dies erklären. Abb. 10: Orientierungseinschätzung durch Primerzugabe Das Ablesen der DNA-Stränge erfolgt immer vom 5 -Ende zum 3 -Ende. Bei der PCR sind 2 Primer notwendig. Der eine ist zum Ablesen des Sense-Stranges, der andere zum Ablesen des Antisense-Stranges verantwortlich. Gibt man zu der PCR Reverse-Primer (PRR) und KB3-Primer hinzu (PCR1), funktioniert die DNA (siehe Abbildung B, schwarze Pfeile), wenn das Insert richtigrum eingebaut wurde. Falls es falschrum eingebaut wurde, funktioniert die PCR mit diesen 2 Primern nicht (Abbildung C, roter Pfeil)! Dreht man diese Tatsache um, so erklärt sich der Fall für die Anwendung des Forward-Primers (FPP). Somit wurde hier in Sense-Richtung einkloniert. Seite von 16

16 Abb. 11: Plasmid-Orientierungsschema 3 Diskussion Zusammenfassend kann man nun feststellen, dass der Versuch funktioniert hat und somit zu einem akzeptablen Ergebnis geführt hat. Wenn ich nun den eigenen Versuchsansatz betrachte, kann man mit dem Ergebnis wohl nur halb zufrieden sein. Haben die Aufreinigung des Plasmids sowie des Inserts perfekt funktioniert, ist der Transformationsschritt absolut missglückt. Allerdings muss man auch bedenken, dass jeder nur eine einzige Probe angesetzt hat, was in einem natürlichen Laborumfeld nicht üblich ist. Nimmt man alle FI-Praktikanten zusammen, ist wohl eine normale prozentuale Erfolgschance am Ende herausgekommen. Seite von 16