3 ERGEBNISSE 3.1 PLASMIDKONSTRUKTIONEN UND -PRÄPARATIONEN

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1 ERGEBNISSE Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, ein in-vitro-modell zur Bestimmung der Zyto- und Genotoxizität zu konstruieren. Zur Entwicklung des Genotoxizitätsmodells wurde der Vektor pnf-κb/neo unter Verwendung des Reportermoleküls degfp hergestellt, dessen Expression in HEK-Zellen durch einen synthetischen Promotor, der vier NF-κB-Bindungsstellen enthält, kontrolliert wird. Um das Zell/Vektor-System herzustellen, wurde der Vektor pnf-κb/neo stabil in HEK-Zellen transfiziert. Außerdem wurden pegfp-n und der neu konstruierte Vektor pcmv-degfp, in denen die Reportergene EGFP und degfp unter Kontrolle eines konstitutiv arbeitenden Promotors stehen, stabil in CHO- und HEK-Zellen transfiziert. Mit Hilfe der entstandenen Zellinien wurden die Quantifizierung von EGFP bzw. degfp durch Messung im Mikrotiterplatten-(MTP)-Fluorimeter und im Durchflußzytometer sowie die Visualisierung im Fluoreszenzmikroskop erprobt. Unter Verwendung dieser stabil transfizierten CHO-Zellen, die EGFP konstitutiv exprimieren, wurde das in-vitro-modell zur Bestimmung der Zytotoxizität entwickelt.. PLASMIDKONSTRUKTIONEN UND -PRÄPARATIONEN.. DNS-Präparationen Für die Transfektionen der CHO- und HEK-Zellen wurden in den meisten Fällen Maxipräparationen der verwendeten Plasmide, und selten auch Minipräparationen eingesetzt. Die Minipräparationen dienten auch der Gewinnung von Ausgangsmaterial für die Klonierung neuer Plasmide (s...). Die Identität der präpararierten DNS wurde durch Agarose- Gelelektrophorese überprüft, ihre Reinheit wurde durch photometrische Bestimmung des OD 60 /OD 80 -Verhältnisses abgeschätzt (Tabelle -). Im allgemeinen wurden nur DNS-Präparationen mit einer OD 60 /OD 80 >,5 für Transfektionen verwendet. Das analytische Gel (Abb. -) zeigt den Ablauf der Maxipräparation am Beispiel des Plasmids pegfp-n. Das geklärte Lysat (L) der Probe (P) enthält monomere Plasmid-DNS. Der Durchlauf D des Lysates sollte nur degradierte RNS enthalten, während die supercoiled Plasmid-DNS an das Anionenaustauscherharz der Säule (Qiagen) bindet. Der Durchlauf und die gemischten Waschfraktionen aus beiden Waschschritten der Säule enthalten keine DNS. Das Eluat enthält monomere supercoiled Plasmid-DNS. Die Spur der Probe zeigt wie die der Ausgangspräparation mehrere Banden, die am weitesten (zwischen 6 und ) gelaufene steht vermutlich für zirkuläres supercoiled Plasmid, darüber befindet sich eine geringe Menge offener zirkulärer Form des Plasmids, und bei 96 zwei weitere Banden, bei denen es sich um Plasmid-Multimere handeln kann. 65

2 Tabelle - Optische Dichte bei 60 nm, DNS-Konzentration der Präparationen Plasmid Probe OD 60 DNS-Konzentration (µg/µl) OD 60 /OD 80 pcx-gfp 0, 0,6 0, 0,7,58,0,5,,,0,0 pegfp-n 0,0 0,0 0,,00,5 pnf-κb-degfp 0, 0,6,8 pcmv-degfp pnf-κb/neo pdegfp- 0, 0,0 0, 0, 0, 0,09 0,09 0,07 0,0 0,05 0,09 0,07 0,08 0,6 0,5 0,57 0,67 0,5 0, 0,7 0,5 0,5 0, 0,5 0, 0,,8,6,8,8,6,,, Abb. - Maxipräparation von pegfp-n Agarose-Gelelektrophorese der pegfp-n-präparation mit Proben aus verschiedenen Schritten der Präparation, %iges Gel. M Marker λ-dns HindIII Digest L Lysat, D Durchlauf, W Waschfraktion und E Eluat der Maxipräparation K pegfp-n Ausgangsprobe, P pegfp-n Maxipräparation 66

3 .. Klonen der Plasmide... Klonen des Plasmids pcmv-degfp pcmv-degfp wurde aus dem degfp-gen des Vektors pdegfp- und dem EGFP-Genlosen Grundgerüst des Vektors pegfp-n zusammengesetzt (Tabelle -6). Dazu wurden die Ausgangsplasmide wie unter Material und Methoden beschrieben mit den Restriktionsenzymen (RE) NotI und XhoI vollständig verdaut. Aus einem präparativem Agarosegel wurden dann die entstandenen Fragmente einer Länge von 90 (degfp-gen) und 9 (EGFP-loses Vektorgrundgerüst von pegfp-n) gewonnen und mittels Bacteriophage T Ligase religiert. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den Ligationsprodukten wuchsen bei einem Insert:Vektor-Verhältnis von : innerhalb von 6 h zwei Kanamycin-resistente Kolonien. Die Transformationseffizienz für das Kontrollplasmid puc9 betrug bei dieser Transformation,x0 7 CFU/µg. Zur Identifikation des rekombinanten Plasmids pcmv-degfp (Abb. -) wurden DNS- Präparationen aus diesen zwei Klonen mit den in Tabelle - genannten RE verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Tabelle - Restriktionsanalyse pcmv-degfp - Fragmentlängen RE pegfp-n pcmv-degfp XhoI 7 (linear) 89 (linear) DrdI EarI HindIII 7 (linear) (Schnittstelle in MODC-Sequenz) PstI 7 (linear) (Schnittstelle in MODC-Sequenz) Die Spuren der Minipräparationen und des Scheinverdaus (Mock) von pegfp-n bzw. der Ligationsprodukte weisen neben einer starken Bande bei ~ kb weitere Banden oberhalb von 0 kb auf, bei denen es sich um multimere Plasmide handelt, da sie bei den Restriktionsverdaus (DrdI, HindIII und PstI) teilweise oder ganz verschwinden (Abb. -). Die entstandenen Fragmente beim Verdau der Ligationsprodukte mit DrdI, HindIII und PstI entsprechen den Erwartungen für das rekombinante Plasmid pcmv-degfp (Tabelle -). 67

4 Abb. - Restriktionsanalyse des rekombinanten Plasmids pcmv-degfp Agarose-Gelelektrophorese des analytischen Verdaus zweier Ligationsprodukte. Aus den zwei Kolonien wurden je zwei DNS-Minipräparationen angefertigt (Lig/Lig, Probe a und b in A, Probe a in B) und jeweils mit XhoI, DrdI bzw. EarI (A) und HindIII bzw. PstI (B) im Vergleich zu pegfp-n (N, Vektorrückgrat des neuen Plasmids) verdaut (s. Tabelle -). M Marker KiloBase Verdau des Minipreps a des Ligationsprodukts Verdau des Minipreps a des Ligationsprodukts Mock Scheinverdau ohne RE 68

5 Tabelle - Restriktionsanalyse pcmv-degfp - Schnittstellen pegfp-n Fragment pdegfp- Fragment pcmv-degfp XhoI XhoI 6 6 NotI 0 NotI Schnittstellen in pcmv-degfp XhoI 89 6 DrdI EarI HindIII PstI Der Verdau mit XhoI ist unvollständig, denn bei den Ligationsprodukten und pegfp-n ist sowohl das erwartete linearisierte Plasmid auf Höhe von,0-5,0 kb als auch eine Bande multimeren Plasmids von über 0,0 kb vorhanden. Beim Verdau mit EarI sind die Banden zwischen und 0 kb nicht auswertbar, das erwartete 877 lange Fragmente ist erkennbar. Der vollständige Verdau von pegfp-n mit DrdI sollte drei Fragmente ergeben (Tabelle -), hier sind jedoch zusätzliche Banden zu erkennen, die durch Multimere des Plasmids (oberhalb von 0 kb), durch linearisiertes Plasmid (~ 5 kb), durch unverdautes supercoiled Plasmid (~ kb) und durch das Fragment ( kb) bedingt sind. Die Verdaureaktionen zeigen, daß es sich bei beiden isolierten rekombinanten Plasmiden um das gewünschte Plasmid pcmv-degfp (Abb. -) handelt, insbesondere da HindIII und PstI das neue Plasmid zweimal schneiden, wobei die zweite Schnittstelle in der MODC-Sequenz des degfp-gens liegt, die pegfp-n nicht enthält. 69

6 P CMV IE degfp Kan R / Neo R CMV Immediate early Enhancer Gen für das destabilisierte EGFP Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen, verleiht Resistenz gegen Kanamycin (bakterieller Promotor P) und Neomycin (SV0 early Promotor) Abb. - Plasmidkarte pcmv-degfp... Klonen des Plasmids pnf-κb/neo pnf-κb/neo wurde aus dem Grundgerüst des Vektors pdegfp- und dem NF-κB-ElementdEGFP-Gen-Fragment aus pnf-κb-degfp zusammengesetzt (Tabelle -8). Dazu wurden die Ausgangsplasmide wie unter Material und Methoden beschrieben mit den RE XbaI und SacI vollständig verdaut. Aus einem präparativem Agarosegel wurden dann die entstandenen Fragmente mit einer Länge von 076 (NF-κB-Element+dEGFP-Gen) und 58 (degfp-loses Vektorgrundgerüst von pdegfp-) isoliert und mittels Bacteriophage T Ligase religiert. Nach Transformation von E. coli DH5α mit den Ligationsprodukten wuchsen bei einem Insert:Vektor-Verhältnis von : und : innerhalb von 9 h je eine Kanamycinresistente Kolonie. Die Transformationseffizienz für das Kontrollplasmid puc9 betrug bei dieser Transformation,0x0 7 CFU/µg. Um das geklonte Plasmid pnf-κb/neo (Abb. -) zu identifizieren, wurden DNS Präparationen aus diesen zwei Klonen mit den in Tabelle - aufgelisteten RE verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. KB TK degfp Tandemkopien der NF-κB- Bindungsstelle minimaler Thymidinkinase- Promotor (HSV Thymidinkinase) Gen für das destabilisierte EGFP Kan R / Neo R * methyliert Aminoglycosid-Phosphotransferase- Gen, verleiht Resistenz gegen Kanamycin (bakterieller Promotor P) und Neomycin (SV0 early Promotor) Abb. - Plasmidkarte pnf-kb/neo 70