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Miriam Glöckner
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1 I 1. Einleitung 1.1. Einfluss erhöhter atmosphärischer CO 2 -Konzentration auf den Stoffwechsel der Pflanze Die globale Bedeutung sekundärer Inhaltsstoffe in der Pflanze Sekundäre Inhaltsstoffe mit Bedeutung für die Pathogenabwehr in Tabak Bedeutung von Glucosyltransferasen im pflanzlichen Sekundärmetabolismus Zielsetzung Material und Methoden 2.1. Pflanzenmaterial Anzuchtbedingungen Zellsuspensionskultur Gewebekultur zur Anzucht transgener Pflanzen Anzucht im Gewächshaus Anzucht in der Klimakammer für Hoch-CO 2 -Experimente Medium für die Anzucht mit definierter Mineralstoffversorgung Bestimmung von C- und N-Gehalten Bestimmung Sekundärer Inhaltsstoffe Bestimmung von Alkaloiden Bestimmung von Methanol-löslichen Phenylpropanen Bestimmung von Zellwand-gebundenen Phenylpropanen Bestimmung von Salizylsäure Identifizierung der Chlorogensäure (CGA)-Isomere Bestimmung des Ligningehaltes Bestimmung der Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL) Aktivität Inokulationsexperimente mit dem Kartoffelvirus Y (PVY) Inokulation von Tabakpflanzen mit PVY Bestimmung des Titers an PVY-Protein durch ELISA Infiltration von Blattscheiben 20

2 II Präparative Extraktion und Reinigung der UDPGlucose:Scopoletin Glucosyltransferase (SGT) durch säulenchromatographische Trennverfahren Extraktion und Ammoniumsulfatfällung Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose Kationenaustauschchromatographie über CM-Sepharose Chromatographie über Hydroxyapatit Gelfiltrationschromatographie über Superdex Affinitätschromatographie über Reactive-Yellow Präparative Isolierung von Scopolin aus Tabakwurzeln Enzymatische Bestimmung der SGT-Aktivität Proteinkonzentrationsbestimmung Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) Molekulargewichtsabschätzung der SGT Expression rekombinanter SGT in E. coli Reinigung des rekombinanten Proteins über Ni-NTA Agarose Gewinnung von Antiseren aus Kaninchen Nachweis von Proteinen durch Western Blot-Hybridisierung Molekularbiologische Standardmethoden Oligonukleotide Vektoren Bakterienstämme Isolierung eines cdna-klons über PCR-Amplifizierung Transformation von Tabak mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens Nachweis von RNA durch Northern Blot-Hybridisierung Peptidmassen-Fingerprint mittels MALDI/TOF-MS Tryptischer Verdau von Proteinen Aufnahme von MS Spektren am MALDI-TOF-MS Ergebnisse 3.1. Untersuchungen der Pathogenabwehr beim Tabak unter variierter CO 2 - und N-Versorgung Fragestellung Experimenteller Ansatz 39

3 III Veränderte C/N-Gehalte in Tabakpflanzen unter erhöhtem [CO 2 ] Veränderte Metabolitprofile in Tabakpflanzen unter erhöhtem [CO 2 ] Untersuchung der Pathogenabwehr in Tabakpflanzen unter erhöhtem [CO 2 ] Reinigung der UDPGlucose:Scopoletin Glucosyltransferase (SGT) Fragestellung Reinigung von Scopolin zur Quantifizierung von HPLC-Analysen Versuche zur Stimulation der SGT-Aktivität Präparative Reinigung der SGT durch säulenchromatographische Trennverfahren Klonierung einer Salizylsäure induzierbaren Glucosyltransferase Isolierung eines cdna-klons über PCR-Amplifizierung Expression rekombinanter SGT in E. coli Reinigung des rekombinanten Proteins über Ni-NTA Agarose Vergleich der Peptidmassen der gereinigten SGT-Aktivität mit der rekombinanten Glucosyltransferase über MALDI/TOF-MS-Analysen MALDI/TOF-MS-Analysen mit der rekombinanten Glucosyltransferase MALDI/TOF-MS-Analysen mit der gereinigten Glucosyltransferase Vergleich der untersuchten Glucosyltransferase mit anderen bekannten Glucosyltransferasen aus Tabak Transformation von Tabak zur Modulation der SGT-Aktivität mit Hilfe von Sense-Konstrukten Selektion geeigneter transgener Linien Charakterisierung der ausgewählten Sense-Linien Untersuchungen zur Wirkung der veränderten SGT-Aktivität auf die Akkumulation von Scopolin und anderen phenolischen Inhaltsstoffen Funktionelle Untersuchungen transgener Linien um den Beitrag von Coumarinen zur Pathogenabwehr zu prüfen Diskussion 4.1. Veränderte Metabolitprofile in Tabakpflanzen unter variierter CO 2 - und N-Versorgung Veränderte Pathogenabwehr in Tabakpflanzen unter variierter

4 IV CO 2 - und N-Versorgung Reinigung und Klonierung einer UDPGlucose:Scopoletin Glucosyltransferase (SGT)-Aktivität Modulation der SGT-Aktivität mit Hilfe von Sense-Konstrukten und Untersuchungen zum Beitrag von Coumarinen zur Pathogenabwehr beim Tabak Zusammenfassung Abkürzungsverzeichnis Literatur 105

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