genehmigte Di s sert ation von Klaus Schmidt aus Groß Lafferde

Transkript

1 Identifizierung eines Cercospora beticola responsiven Bereichs innerhalb des Kernpromotors despa/-gens der Zuckerrübe sowie eines daran bindenden, neuen Transkriptionsfaktors Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.) genehmigte Di s sert ation von Klaus Schmidt aus Groß Lafferde

2 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG Die Zuckerrübe Pflanze Pathogen Interaktion Die Phenylalanin Ammonium Lyase (PAL) Die Transkriptionsinitiation Interaktion Cercospora beticola- Zuckerrübe Ziel der Arbeit 18 2 MATERIAL UND METHODEN Chemikalien Medien Bakterienanzuchtmedien LB-Medium YEB Medium Pflanzenkulturmedium MS-Medium Bakterienstämme Escherichia coli Agrobacterium tumefaciens Molekularbiologische Standardtechniken Allgemeine molekularbiologische Techniken Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli Transformation von Agrobacterium tumefaciens Herstellung kompetenter A. tumefaciens Zellen Chemische Transformation von Plasmid-DNA in A. tumefaciens Extraktion von Plasmid-DNA aus A. tumefaciens mit dem Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten Elektroporation von E.coli Quantifizierung von Nukleinsäuren Photometrische Bestimmimg der Nuklemsäurekonzentration Quantifizierung im Agarosegel 24

3 2.5.3 Quantifizierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Proteinbestimmung PCR-Analysen Primerdesign LD-PCR Routinemäßige PCR Transkriptionelle Untersuchungen von infizierten Zuckerrübenblättern RNA Extraktion aus Zuckerrübenblättem Formaldehyd-Agarosegele Blotten der RNA auf eine Nylonmembran Hybridisierung immobilisierter Nukleinsäuren mit radioaktiv markierten Sonden Radioaktive Markierung der Sonden Hybridisierung Entfernen der Sonden von Nylonfiltern Southern Blot Untersuchungen Gewinnung genomischer DNA Southern Blot " Screening von DNA-Banken Screening einer cdna-bank Screening einer genomischen A.-Bank Gewinnung eines einzelnen ^.-Klons Gewinnung von DNA aus A.-Phagen Bestimmumg des Bvpal- Transkriptionsstartpunktes Labeling des Primers Vorbereitung der RNA Primer Extension Denaturierende Polyacrylainid-Gelelektrophorese cdna-synthese Sequenzmarker Electrophoretic Mobility Shift Assays (EIMSA) Herstellung eines Ganzzellextraktes aus Zuckerrübenblättem Radioaktive Markierung der dsdna-oligonukleotide Annealing komplementärer ssoligonukleotide 40

4 radioaktive Markierung der dsoligonukleotide Bindungsansatz: Transiente, biolistische Transformation von Pflanzengewebe Vorbereiten des Goldes Herstellung der Microcarrier Beladung der Microcarrier (für 6 Schuß) Transiente, biolistische Transformation von Blattrondellen Bestimmung der Luciferaseaktivitäten mit dem Dual Luciferase Reporter Assay Einbettung von Blattrondellen zur mikroskopischen Untersuchung Infektion von Zuckerrüben mit Cercospora beticola Pflanzenmaterial Anzucht des Pilzes Inokulation von Zuckerrüben Histologische Untersuchungen von infiziertem Blattgewebe PAL-Enzymassay Enzymextraktion Enzymtest " Erstellung von Reportergenkonstrukten mit dem ßv/ui/-Promotor Erstellung von 5'-Promotordeletionen Erstellung vom 3'-Deletionskonstrukten Erstellung des Plasmids p-34/+45palluc Fusionen zwischen Siyo/-5'-UTR Bereich und d35s-promotor Einfügen von Punktmutationen im Bereich von -23 bis +3 des ßvpa/-Promotors im Reportergenkonstrukt p-34palluc Umklonierung des Bereichs -23 bis +3 des ßv/>/i/-Promotors in den d35s- Promotor Amplifikation der Einzelfragmente Ligation der PCR-Fragmente Erstellung einer stabil transformierten Zuckerrüben-Suspensionskultur Stabile Transformation von Zuckerrübenkallus Erstellung von stabilen transgenen Tabakpflanzen Blattscheibentransformation von Tabak (SRI) One Hybrid Screen 58

5 Erstellung eine cdna Bank im Vektor pgad Screening der cdna Bank im One Hybrid Screen Überexpression eines Proteins in E. coli Statistische Verrechnung von Meßwerten 61 3 ERGEBNISSE Reduktion der 2?vpa/-Transkriptmenge nach Infektion von Zuckerrüben mit Cercospora beticola Verlauf der ßvpo/-Transkriptakkumulation bei Sporen/ml Verlauf der 5vpa/-Transkriptakkumulation bei Sporen/ml Reduktion der BvPAL-Enzymaktivität nach Infektion von Zuckerrüben mit C. beticola Induktionsverlauf der BvPAL-Enzymaktivität bei Sporen/ml Induktionsverlauf der BvPAL-Enzymaktivität bei Sporen/ml Korrelation zwischen Transkriptmenge und Enzymaktivität Korrelation zwischen der 0v/>a/-Transkriptmenge und der Bvc4h- Transkriptmenge Isolierung des Promotors des pal-gens der Zuckerrübe Southern Blot Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl des pal-gens im Genom der Zuckerrübe Isolierung eines Vollängen cdna Klons des 5vp«/-Gens aus dem Zuckerrübengenotyp 4B Isolierung des/w/-gens der Zuckerrübe Isolierung eines X-Phagen mit dem Bvpal-Gen DNA-Sequenzbestimmung des isolierten genomischen Fragmentes Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes des ßvpo/-Gens Identifizierung von möglichen Proteinbindungsstellen im putativen Bvpal- Promotor Charakterisierung des fivpa/-promotors Erstellung von translationellen Fusionen des putativen ßvpa/-Promotors mit unterschiedlichen Reportergenen Erstellung eines internen Standards für die transiente, biolistische Transformation Bestimmung der relativen Promotoraktivität von 5' Deletionskonstrukten des Svpa/-Promotors 90

6 Aktivität der Reportergenkonstrukte mit unterschiedlichen Bvpal- Promotorfragmenten Bestimmung der Eindringtiefe der Microcarrier bei der biolistischen Transformation Einfluß des Bvpal 5-UTR auf die Expressionshöhe desfivpa/-promotorsund des d35s-promotors Transiente Expressionsstudien Verkleinerung des Bvpal-5'-VTR. in den ßvpa/-Reportergenkonstrukten Einfluß des Bvpal-S'-UTK Bereichs auf die Aktivität des 35 S-Promotors Einfluß des Bvpal-5 -UTR auf die Aktivität des d35s-promotors in stabil transformiertem Tabak Transiente Testung der d35s-promotor::si77fl/-5'-utr Reportergen-konstrukte Aktivität der d35s-promotor::sv/ra/-5'-utr Reportergenkonstrukte im transgenen Tabak Einfluß eines Wundreizes auf die Luciferaseaktivität im transgenen Tabak transformiert mit dem Konstrakt pbi70s+l l/+2481uc/70sruc Eingrenzung des Bereichs auf demfivpa/-promotor,der für die transkriptioneile Repression nach Infektion mit C. beticola verantwortlich ist Eignung des transienten Testsysterns Eingrenzimg des verantwortlichen Promotorbereichs Testung des Plasmids p-97palluc Testung des Plasmids p-34palluc Testung des Plasmids p-34/+45palluc Bestimmung von Proteinbindungsstellen am eingegrenzten Promotorbereich Nachweis der Bindung von Proteinen an die verwendeten Oligonukleotide Reaktion der L-Box auf unterschiedliche Ganzzellextrakte Nachweis der sequenzspezifischen Bildung des Komplexes S am ds- Oligonukleotid rl4b Eingrenzung der Proteinbindungsstelle im ds-oligonukleotid rl4b Einfluß von Punktniutationen an Position -15 und -20 auf die Ausbildung des Komplexes S Bildung des Komplexes S an mutierten ds-oligonukleotiden von rl4b im EMSA 122

7 Einfluß von Punktmutationen im Bereich -23 bis +3 auf die Expressionshöhe des Reportergenkonstruktes p-34palluc nach transienter, biolistischer Transformation in Zuckerrübenblätter Konstruktion von Chimären 35S-Ävp«/-Promotoren Funktionalität der Konstrukte p70s-23/+2481uc und p70s-23/+101uc Nachweis des Repressionsphänomens mit dem Plasmid p70s-23/+101uc Identifizierung möglicher Transkriptionsfaktoren, die am Bereich -23 bis +3 des /Sv/;a/-Promotors binden One Hybrid Screen mit rl4b als Köder Überexpression des möglichen Transkriptionsfaktors BvOHl 5 in E. coli Nachweis der spezifischen DNA-Bindung des Proteins BvOH15 an die Sequenz -23 bis +3 des Bvpal-Gens 139 Nachweis der Interaktion von BvOHl5 mit dem 5vpfl/-Promotor in vivo Identifizierung des möglichen von C. beticola während der Infektion abgegebenen Suppressors DISKUSSION Repression der Phenylalanin Ammonium-Lyase und der Zimtsäure-4- Hydroxylase Expression in Zuckerrübenblättern nach Infektion mit C. beticola Identifizierung des für die Repression verantwortlichen cis-elementes auf dem Promotor des Bvpal-Gens Charakterisierung des Ävpo/-Promotors Eingrenzung des für die Repression verantwortlichen Promotorbereichs Identifizierung möglicher DNA-bindender Proteine Modeil zur Interaktion zwischen der C. beticola Infektion und der Bvpal- Transkription ZUSAMMENFASSUNG LITERATURNACHWEIS ANHANG 195