Jens Tilsner (Autor) Aminosäuretransport in Raps unter besonderer Berücksichtigung des Entwicklungsstadiums der Pflanze und der Stickstoffdüngung

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1 Jens Tilsner (Autor) Aminosäuretransport in Raps unter besonderer Berücksichtigung des Entwicklungsstadiums der Pflanze und der Stickstoffdüngung Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Stickstoff als pflanzliches Nährelement 1.2 Assimilation von anorganischem Stickstoff 1.3 Ferntransport von Assimilaten und Ionen in der Pflanze 1.4 Anatomie des Phloems 1.5 Phloem-Beladungsmechanismen 1.6 Phloem-Entladung 1.7 Verlagerung von Stickstoff in der Pflanze: Source-Sink-Verhältnisse 1.8 Identifizierung pflanzlicher Aminosäuretransporter 1.9 Familien von Aminosäuretransportern in Arabidopsis 1.10 Die Problematik der Stickstoffnutzung bei Raps 1.11 Zielsetzung Material und Methoden 2.1 Allgemeines 2.2 Material Pflanzenmaterial und Anzucht Bakterienstämme Häufig verwendete Nährmedien Plasmide 2.3 Feldversuch zur Untersuchung der genetischen Variabilität der Stickstoffnutzung bei Winterraps Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität (NRA) 2.4 Extraktion von Metaboliten aus Pflanzengeweben Chloroform-Methanol-Extraktion von Blattgeweben Nichtwässrige Fraktionierung Mannosidase-Test Saure Phosphatase-Test Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase-Test

3 II Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Test Extraktion von Apoplastensaft 2.5 Metabolit-Messungen Chromatographische Bestimmung von Aminosäuren Chromatographische Bestimmung von Zuckern Chromatographische Bestimmung von Ionen 2.6 Methoden zur Isolierung von Proteinen Isolierung von Plasmamembran-Proteinen aus Pflanzen Anreicherung von Plasmamembran-Proteinen in einem Zwei-Phasen System P-ATPase-Test 2.7 Quantitative Proteinbestimmung Proteinbestimmung nach Bradford Proteinbestimmung nach Lowry Proteinbestimmung mit dem D C Protein Assay Chlorophyllbestimmung 2.8 Gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Coomassie-Färbung Silverstain-Färbung KCl-Färbung und Elution von Proteinen aus präparativen SDS-Gelen 2.9 Präparation und Reinigung von Nukleinsäuren Isolation von RNA Mini-Präparation pflanzlicher Gesamt-RNA Extraktion großer Mengen pflanzlicher Gesamt-RNA Isolation genomischer pflanzlicher DNA Isolation bakterieller Plasmid-DNA Plasmid-Mini-Präparation aus E. coli Plasmid-Maxi-Präparation aus E. coli Plasmid-Mini-Präparation aus Agrobacterium tumefaciens Ethanolfällung von DNA oder RNA Phenol/Chloroform-Reinigung von DNA oder RNA Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen

4 III 2.10 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 2.11 Hybridisierungsmethoden Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten ( Random Priming ) Northern Blot 2.12 cdna-synthese 2.13 Auf der Polymerase-Kettenreaktion basierende Methoden Kriterien bei der Ableitung von synthetischen Oligonukleotiden (Primern) Polymerase-Kettenreaktion Kolonie-PCR Amplifikation von cdna-enden (RACE) Identifizierung des Transkriptions-Endpunktes durch 3 RACE Identifizierung des Transkriptions-Startpunktes durch 5 RACE Amplifikation von Promotoren durch Genome Walking Herstellung einer Genome Walker Library Genome Walking PCR DNA-Sequenzierung 2.14 Klonierungsmethoden Restriktionsverdau von DNA-Fragmenten Auffüllen von überstehenden Enden doppelsträngiger DNA-Moleküle Alkalische Phosphatase-Behandlung Ligation von DNA Herstellung chemokompetenter E. coli Zellen Herstellung kompetenter Zellen nach der Rubidiumchlorid- Methode Herstellung kompetenter Zellen nach Inoue et al. (1990) Chemische Transformation von E. coli Herstellung elektrokompetenter Agrobacterium tumefaciens Zellen Elektroporation von Agrobacterium tumefaciens Bakteriendauerkultur Transformation von Arabidopsis thaliana

5 IV 2.15 Funktionelle Expression von Membranproteinen in Xenopus Oocyten 2.16 Nachweis der Promotoraktivität durch einen histochemischen GUS-Test 2. Immunologische Methoden 2..1 Herstellung von polyklonalen Antikörpern 2..2 Western-Blot 2..3 Immunohistochemischer Nachweis von Proteinen in Gewebeschnitten Einbettung von Pflanzengewebe in Methacrylat Herstellung von Dünnschnitten Behandlung der Schnitte mit Antikörpern und Fluoreszenzfarbstoffen 2.18 Computergestützte Analyseverfahren Sequenzanalyse von DNA und Proteinen Untersuchungen zur Proteinstruktur 2.19 Statistische Auswertung der Experimente Ergebnisse Feldversuche zur Variabilität der Stickstoffnutzung und -verteilung in B. napus 3.2 Aminosäurekonzentrationen in subzellulären Kompartimenten von Mesophyllzellen 3.3 Aminosäurekonzentrationen im Apoplasten und Vergleich der Aminosäure-Zusammensetzung in den untersuchten Kompartimenten 3.4 Identifizierung von Brassica napus Aminosäuretransportern BnAAP BnAAP BnAAP2 3.5 Elektrophysiologische Untersuchungen zur Substratspezifität von BnAAP1 und BnAAP6 durch funktionelle Expression in Xenopus Oozyten 3.6 Untersuchungen zur Expression von BnAAP1 und BnAAP6 in der Pflanze Untersuchung einer BnAAP6-Promotor-Reportergenfusion Herstellung von BnAAP6-spezifischen polyklonalen Antikörpern

6 V Expression von BnAAP1 und BnAAP6 in verschiedenen Blattaltersstufen BnAAP BnAAP Diskussion Variabilität der Stickstoffeffizienz bei Winterraps 4.2 Subzelluläre Konzentrationen und Phloembeladung von Aminosäuren in Raps 4.3 Charakterisierung von Aminosäuretransportern aus Raps 4.4 Expression von BnAAP1 und BnAAP6 in der Pflanze 4.5 Expression von BnAAP1 und BnAAP6 während der Blattentwicklung 4.6 Möglichkeiten zur gentechnischen Verbesserung der Stickstoffeffizienz von Raps 5 Zusammenfassung Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Anhang 8.1 Verteilung der Markerenyzme bei der nichtwässrigen Fraktionierung 8.2 cdna- und Aminosäuresequenz von BnAAP1 8.3 cdna- und Aminosäuresequenz von BnAAP6 8.4 Nukleotidsequenz des BnAAP6-Promotors 8.5 Partielle cdna- und Aminosäuresequenz von BnAAP2 8.6 Vektorkarten

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