Johannes Gierlich (Autor) Selektive Modi_kation von DNA durch kupferkatalysierte 1,3- Dipolare Cycloaddition

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1 Johannes Gierlich (Autor) Selektive Modi_kation von DNA durch kupferkatalysierte 1,3- Dipolare Cycloaddition Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 Zusammenfassung Summary xi xiii 1. Einleitung Festphasensynthese Polymerase Kettenreaktion (PCR) Postsynthetische Modifikation Aufgabenstellung 8 3. Modifikationen an DNA ,3-Dipolare Cycloaddition an DNA ( Click -Chemie) Einleitung ,3-Dipolare Cycloadditionen Click -Cycloaddition Mechanismus Kupferquellen und Additive Variationen Anwendungen Click -Chemie an DNA Eingesetzte Alkine und Azide Synthese der Alkinthymidine Synthese der Triphosphate Synthese von 7-Desaza-7-(okta-1,7-diinyl)-2 -desoxyguanosin (26) Verwendete Azide Reaktion an Oligonukleotiden Synthese von Oligonukleotiden mit Alkinen Reaktion an DNA Reaktion mit PCR-Produkten vii

3 PCR-Produkte mit wenigen Alkinen PCR-Produkte aus Alkintriphosphaten Alkine in Zellen Andere Monomere für terminale Alkine Microcontact Printing (μcp) mit Alkin-DNA Ausblick Polymerase Kettenreaktion mit modifizierten Triphosphaten Einleitung Thermophile Polymerasen Quantitative PCR (qpcr) Primerverlängerung (primer extension) Einbau modifizierter Basen Bisherige Arbeiten Primerverlängerung mit Alkin- und Azidtriphosphaten PCR mit modifizierten Triphosphaten Primer und Template Polymerasen Herstellung eines PCR-Produkts mit 300 Basenpaaren Herstellung eines PCR-Produkts mit 900 Basenpaaren Herstellung eines PCR-Produkts mit 2000 Basenpaaren Ausblick Detektion von DNA Einleitung Abscheidung von Silber durch Aldehyde Silberfärbung von Gelen Silberfärbung von Gelen mit Tollens-Reagenz Anfärbung von Membranen Funktionalisierung von DNA mit Aldehyden Direkter Einbau von Aldehydfunktionen in DNA Schutzgruppen für Aldehyde Synthese der Monomere Einbau in DNA Postsynthetische Funktionalisierung mit Aldehyden Ausblick viii

4 7. DNA als Templat zur Abscheidung von Metallen Einleitung Metallisierung von DNA Herstellung von partiell modifizierter DNA Ausblick Experimenteller Teil Material und Methoden Synthese der Alkinmonomere Synthese von 5-Ethinyl-2 -desoxyuridin (6) Synthese von 5-(Hexa-1,5-diinyl)-2 -desoxyuridin (10) Synthese von 5-(Okta-1,7-diinyl)-2 -desoxyuridin (12) Synthese von 7-Desaza-7-(okta-1,7-diinyl)-2 -desoxyguanosin (26) Synthese von 5-((2-Cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphonoxy)-pent-1-in (51) Synthese der Azide Synthese der Aldehydbausteine Synthese von 5-(4-[1,3]Dioxan-2-yl-phenylethinyl)-2 - desoxyuridin (55) Synthese von 5-(3-(1,2:3,4-Di-O-isopropyliden-6-O-α-Dgalactopyranosyl)-prop-1-inyl)-5 -O-triphosphat-2 -desoxyuridin (66) und 5-(5-(1,2:3,4-Di-O-isopropyliden-6-O- α-d-galactopyranosyl)-pent-1-inyl)-5 -O-triphosphat-2 - desoxyuridin (71) Sonstige Substanzen α/β-Chlor-2-desoxy-3,5-p-toluoyl-D-ribofuranose (29) Chloro-5,6-benzo-l,3,2-dioxaphosphorin-4-on Synthese der DNA Oligomere Click -Protokolle Für DNA-Oligomere Für PCR-Produkte Aufreinigung durch Fällung mit Ethanol Metallisierung Lösungen Protokolle Biochemische Arbeiten Material und Methoden Enzymatischer Abbau von DNA ix

5 Gele Präparation der Plasmide Primerverlängerung PCR-Primer und -Produkte PCR-Bedingungen PCR-Produkt mit 300 Basenpaaren PCR-Produkt mit 900 Basenpaaren Aufreinigung der PCR-Produkte Sequenzierung HPLC-MS-MS-Experimente von enzymatisch abgebauten PCR-Produkten Restriktion der PCR-Produkte Inkorporation der Alkine in Zellen A. Anhang 179 A.1. Syntheseprotokolle für modifizierte Oligonukleotide A.1.1. Protokoll Glenn_110804_long A.2. PCR-Programme A.3. Daten der DNA-Sequenzierung B. Nummerierung der Verbindungen 189 B.1. Kleine Moleküle B.2. Oligonukleotide Abkürzungsverzeichnis 193 Literaturverzeichnis 196 Danksagung 231 Lebenslauf 233 x