Kerstin Brachhold (Autor) Das Basalapparat-Subproteom von Chlamydomonas reinhardtii
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1 Kerstin Brachhold (Autor) Das Basalapparat-Subproteom von Chlamydomonas reinhardtii Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:
2 INHALTSVERZEICHNIS i Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG Deutsche Zusammenfassung Englische Zusammenfassung/Abstract EINLEITUNG Chlamydomonas reinhardtii als Modellorganismus Centrosomen und Centriolen Der Basalapparat von Chlamydomonas reinhardtii Fragestellung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Material Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Kit -Systeme Enzyme Antikörper Oligonukleotide Membranen, Filter, Dialyse Standardpuffer und lösungen Algenstämme und Kulturbedingungen Chlamydomonas reinhardtii cw Kulturmedium HSM ( high salt concentration medium ) Kulturmedium TAP (Tris-Acetat-Phosphat) Sterilisation der Medien Präparative Methoden Isolierung von Basalapparaten Präparation von Cytoskeletten für die indirekte Immunfluoreszenz Reinigung der rekombinanten Proteine Reinigung von IgGs aus Präimmun- und Immunseren Proteinbiochemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Coomassie-Färbung von Proteingelen... 34
3 ii INHALTSVERZEICHNIS Silberfärbung von Proteingelen Elektroelution Dialysen Gefriertrocknung von Proteinen Elektrophoretischer Transfer von Proteinen aus Gelen auf Membranen (Western-Blot) Ponceau-Färbung von PVDF-Membranen Amidoschwarz-Färbung von PVDF-Membranen Proteinbestimmung nach Neuhoff Proteinbestimmung mit Coomassie Plus-Reagenz Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-PAGE) Probenvorbereitung Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF) Zweite Dimension: Vertikale SDS-PAGE Elektronenmikroskopie Befilmen der Kupfernetzchen whole mount -Elektronenmikroskopie Anfertigung von Präparaten für Ultradünnschnitte Kontrastierung der Ultradünnschnitte Elektronenmikroskop und Filmmaterial Antikörper Gewinnung der Antigene Immunisierungen Immunologische Methoden Western-Blot Indirekte Immunfluoreszenz an isolierten Cytoskeletten Massenspektrometrische Protein-Analytik Elektronenspray-Ionisation mit Tandem-MS Technik (ESI-MS/MS) MudPIT ( multidimensional protein identification technology ) Molekularbiologische Methoden Isolierung von Gesamt-RNA cdna-erststrangsynthese Isolierung von DNA (CTAB-Methode)...46
4 INHALTSVERZEICHNIS iii Vektoren und Bakterienstämme Ligation Transformation Plasmidpräparation (Miniprep) Proteinexpression der partiellen cdnas Restriktionsverdau Agarosegelelektrophorese PCR DNA-Sequenzierung Verwendete Datenbanken und Computerprogramme ERGEBNISSE Isolierung von Basalapparaten aus Chlamydomonas reinhardtii Ansätze zur Identifikation der Proteine des Basalapparates D-Gel-Ansatz MudPIT-Analyse D-Gel-Ansatz Kandidaten für weitere Untersuchungen Nähere Charakterisierung von 5 potentiellen Basalapparat-Proteinen Kandidat 20: Schließen von genomischen Sequenzlücken Klonierung von partiellen cdnas für 4 Kandidaten Umklonierung der partiellen cdnas in den Expressionsvektor petblue Expression der partiellen cdnas und Reinigung der rekombinanten Proteine Western-Blot-Analyse der Antiseren bzw. gereinigten Antikörper Lokalisation der 4 Kandidaten durch indirekte Immunfluoreszenz DISKUSSION Isolierung von Basalapparaten aus C. reinhardtii Proteinzusammensetzung isolierter Basalapparate Ansätze zur Identifikation der Proteine des Basalapparates Vergleich der Genmodelle, die bei den unterschiedlichen Ansätzen gefunden wurden Charakterisierung von 5 neuen, potentiellen Basalapparatproteinen Ausblick
5 iv INHALTSVERZEICHNIS 6 LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Sequenzen der verwendeten Primer Liste der identifizierten Genmodelle VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN UND TABELLEN ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...144
Inhaltsverzeichnis. 1. Einleitung... 9. 2. Material und Methoden... 32
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung... 9 1.1 Posttranslationale Modifikationen... 10 1.2 N-Glykosylierung... 11 1.3 O-Glykosylierung... 12 1.4 Veränderungen der Glykosylierung bei der Tumorentstehung... 13
MehrAbbildungsverzeichnis
I INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungen VI Abbildungsverzeichnis VIII I. Einleitung 1. Neurone und Axonwachstum 1 2. Oligodendrozyten und Myelin 3 3. Das Proteolipid Protein (PLP) 6 4. Mutationen im PLP-Gen und
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